(11)	018174 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	201000077
(22)	2008.06.26
(51)	C12N 15/86 (2006.01) C12N 15/62 (2006.01) C07K 14/11 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) A61K 39/145 (2006.01)
(31)	60/946,644; 07450176.8
(32)	2007.06.27; 2007.10.05
(33)	US; EP
(43)	2010.06.30
(86)	PCT/EP2008/058154
(87)	WO 2009/007244 2009.01.15
(71)	(73) АВИР ГРИН ХИЛЗ БАЙОТЕКНОЛОДЖИ РИСЕРЧ ДИВЕЛОПМЕНТ ТРЕЙД АГ (AT)
(72)	Волшек Маркус, Егоров Андрей, Бергманн Михаэль, Мустер Томас, Киттель Христиан (AT)
(74)	Саломатина И.С. (RU)
(54)	ВИРУС ГРИППА С НАРУШЕННОЙ РЕПЛИКАЦИЕЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

(57) 1. Вирус гриппа с нарушенной репликацией, включающий:

а) модифицированный NS сегмент, кодирующий NS1 белок, включающий по меньшей мере 10 N-концевых аминокислот, где участок связывания РНК расположен между аминокислотами 1 и 73, а эффекторный участок расположен между аминокислотой 74 и С-концевым аминокислотным остатком, где указанные участки утратили свои функции из-за аминокислотных делеций, и

б) гетерологичную последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, вставленную в NS сегмент гена.

2. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по п.1, включающий до 14, предпочтительно до 30 аминокислотных остатков с N-конца NS1 белка.

3. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1 или 2, в котором удалены аминокислотные остатки 134-161 или аминокислотные остатки 117-161.

4. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-3, включающий сигнальный пептид или его часть, присоединенную к С-концу NS1 белка.

5. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-4, в котором гетерологичная последовательность экспрессируется с открытой рамкой считывания NS1 с другой открытой рамки считывания.

6. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-5, в котором гетерологичную последовательность выбирают из группы, состоящей из биологически активных белков, их антигенов или производных или фрагментов.

7. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-6, в котором гетерологичная последовательность представляет собой антиген, хемокин, цитокин или их производное или фрагмент, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из Mycobacterium tuberculosis, IL-2, GM-CSF, EL-15, MIP1a и MIP3a, ESAT-6 или их фрагмента или производного.

8. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.4-7, в котором гетерологичная последовательность включает сигнальный пептид, полученный из легкой цепи антитела, предпочтительно из k-цепи иммуноглобулина (IgK), более предпочтительно из IgK цепи мыши.

9. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по п.8, в котором сигнальный пептид IgK включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков, предпочтительно включает последовательность METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID No. 11), или METDTLLLWVLLLWVPRSHG (SEQ ID No. 82), или ее часть.

10. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-9, в котором трансляция указанного NS1 белка заканчивается с помощью по меньшей мере одного стоп-кодона и экспрессия указанной гетерологичной последовательности инициируется старт-кодоном.

11. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-10, в котором открытая рамка считывания гетерологичной последовательности, по меньшей мере, частично перекрывается с открытой рамкой считывания NS1.

12. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-11, в котором трансляция с открытой рамки считывания гетерологичной последовательности инициируется последовательностью перекрывающихся стоп-старт-кодонов, которая предпочтительно представляет собой TAATG (SEQ ID No. 81) или UAAUG (SEQ ID No. 53).

13. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-12, содержащий измененную последовательность, расположенную после донорного участка сплайсинга и/или перед акцепторным участком сплайсинга в NS сегменте.

14. Вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-13, включающий последовательность SEQ ID No. 1-10, 67, 68 или по меньшей мере на 98% гомологичную им.

15. Вакцина, включающая вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14.

16. Применение вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14 для получения лекарственного средства для терапевтического лечения больных.

17. Вектор, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую вирус гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14.

18. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14, включающий стадии

трансформации клеток, предпочтительно Vero клеток, вектором по п.17 предпочтительно вместе с очищенным препаратом RNP комплекса вируса гриппа,

необязательно инфицирования трансфецированных клеток вспомогательным (хелперным) вирусом гриппа,

инкубации инфицированных клеток для развития потомства вируса и

отбора трансформированных клеток, которые экспрессируют модифицированный NS ген и гетерологичную последовательность.

19. Способ получения вируса гриппа с нарушенной репликацией по любому из пп.1-14, включающий стадии

трансфецирования клеточной линии, предпочтительно линии Vero клеток, ДНК вектором, включающим модифицированный NS ген, лишенный функционального домена связывания РНК, и гетерологичную последовательность, помещенную между функциональным донорным участком сплайсинга и акцепторным участком сплайсинга NS гена;

отбора трансфецированных клеток, которые продуцируют вирус, экспрессирующий модифицированный NS ген и гетерологичную последовательность,

инфицирования отобранных клеток требуемым вирусом гриппа,

инкубации инфицированных клеток для развития потомства вируса, содержащего гетерологичный белок,

отбора и сбора указанного потомства вируса, содержащего гетерологичный белок.

20. Модифицированный NS сегмент гена, кодирующий NS1 белок, включающий по меньшей мере 10 N-концевых аминокислот, где участок связывания РНК расположен между аминокислотами 1 и 73, а эффекторный участок расположен между аминокислотой 74 и С-концевым аминокислотным остатком, где указанные участки утратили свои функции из-за аминокислотных делеций, а гетерологичная последовательность между функциональным донорным участком сплайсинга и функциональным акцепторным участком сплайсинга, вставленная в NS сегмент гена, дополнительно содержит сигнальный пептид, присоединенный к С-концу указанного NS1 белка, где указанный сигнальный пептид предпочтительно состоит из 8-50 аминокислотных остатков.

21. Модифицированный NS сегмент по п.20, в котором сигнальный пептид получен из легкой цепи антитела, предпочтительно из k-цепи иммуноглобулина, более предпочтительно из IgK цепи мыши или ее производного, где предпочтительно указанный сигнальный пептид IgK включает по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно по меньшей мере 12 аминокислотных остатков и предпочтительно включает последовательность METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ ID No. 11), или METDTLLLWVLLLWVPRSHG (SEQ ID No. 82), или ее часть.