(11) | 017963 (13) B1 |
    Разделы: A B C D E F G H  |
(21) | 200970012 |
(22) | 2006.06.15 |
(51) | C12N 9/20 (2006.01)
C07K 14/39 (2006.01)
C12P 21/02 (2006.01)
C12N 1/16 (2006.01)
A61K 38/46 (2006.01) |
(43) | 2009.10.30 |
(86) | PCT/FR2006/001352 |
(87) | WO 2007/144475 2007.12.21 |
(71) | (73) ЛАБОРАТУАР МЕЙОЛИ СПЭНДЛЕР (FR) |
(72) | Леблон Ив, Му Николя, Марти Ален, Юрибеларреа Жан-Луи (FR) |
(74) | Медведев В.Н. (RU) |
(54) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПАЗЫ, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ КЛЕТКА YARROWIA LIPOLYTICA, СПОСОБНАЯ ПРОДУЦИРОВАТЬ УКАЗАННУЮ ЛИПАЗУ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
(57) 1. Способ получения рекомбинантной липазы, включающий:
a) стадию культивирования клеток Yarrowia lipolytica, трансформированных вектором, включающим кассету экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой липазы; и
b) стадию выделения рекомбинантной липазы, продуцированной указанными клетками, из супернатанта культуры,
где указанный способ отличается тем, что стадию а) культивирования выполняют в культуральной среде, не содержащей продуктов животного происхождения или неохарактеризованных смесей, состоящих из белковых материалов животного происхождения или продуктов их ферментативного расщепления, и тем, что указанная культуральная среда включает
в качестве источника азота неорганический азот;
источник углерода, выбранный из источников углерода углеводной природы, многоатомных спиртов, таких как глицерин, а также источников углерода липидной природы, таких как жирные кислоты и ацилглицерины; и
неорганические соли, микроэлементы и витамины.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия а) включает:
a1) прекультивирование трансформированных клеток Yarrowia lipolytica в среде, содержащей источник углерода углеводной природы; и
а2) стадию ферментации, включающую фазу роста клеток в среде, содержащей источник углерода углеводной природы, и фазу синтеза липазы в среде, содержащей в качестве единственного источника углерода жирную кислоту, выбранную из триглицеридов с короткой, средней или длинной цепью.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что ферментацию проводят при постоянном рО2 от 15 до 25% и рН ниже 6,5.
4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что стадию a1) прекультивирования выполняют до достижения показателя OD600 3-10 в 1 мл, а в стадии а2) ферментации указанная фаза синтеза липазы начинается, когда OD600 культуры достигает значения 60-80 в 1 мл.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что стадию b), в ходе которой выделяют липазу, начинают, когда OD600 достигает значения 300-350 в 1 мл.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что стадия b) включает:
b1) выделение липазы из указанного супернатанта культуры;
b2) очистку липазы, полученной в b1).
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанное выделение выполняют с использованием методики, выбранной из тангенциальной фильтрации через полое волокно, фронтальной фильтрации и непрерывного или периодического центрифугирования, а указанную очистку выполняют с использованием методики, выбранной из фильтрации, фракционного осаждения, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия и гель-фильтрационной хроматографии.
8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что стадия а) заключается в культивировании клона дрожжей Yarrowia lipolytica YL-LIP2-6C.
9. Препарат дрожжевой кислотоустойчивой рекомбинантной липазы, полученный способом, включающим:
a) стадию культивирования клеток Yarrowia lipolytica, трансформированных вектором, включающим кассету экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой липазы; и
b) стадию выделения рекомбинантной липазы, продуцированной указанными клетками, из супернатанта культуры,
где способ отличается тем, что стадию а) культивирования выполняют в культуральной среде, не содержащей продуктов животного происхождения или неохарактеризованных смесей, состоящих из белковых материалов животного происхождения или продуктов их ферментативного расщепления, а содержащей
в качестве источника азота неорганический азот;
источник углерода, выбранный из источников углерода углеводной природы и источников углерода липидной природы; и
неорганические соли, микроэлементы и витамины,
отличающийся тем, что указанный препарат обладает каталитической активностью при рН 6 по меньшей мере 15000 единиц в 1 мл супернатанта культуры, предпочтительно более 20000 единиц в 1 мл супернатанта культуры, причем одна единица соответствует количеству фермента, способному катализировать образование 1 мкмоль жирной кислоты в 1 мин, когда используемый субстрат является триоктаноином, и/или тем, что концентрация указанной липазы в указанном препарате выше, чем 1 г липазы на 1 л.
10. Применение препарата липазы по п.9 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения синдрома мальабсорбции жира, связанного с недостаточностью поджелудочной железы.
11. Клон дрожжей Yarrowia lipolytica C.N.C.M. YL-LIP2-6C, трансформированный вектором, включающим кассету экспрессии дрожжевой кислотоустойчивой внеклеточной липазы, для получения кислотоустойчивой липазы.
12. Применение клетки по п.11 при получении дрожжевой кислотоустойчивой липазы.
13. Лекарственное средство, включающее препарат липазы по п.9 и предназначенное для лечения синдрома мальабсорбции жира, связанного с недостаточностью поджелудочной железы.
| 
