(57) Для того чтобы обратиться к ограничениям, возникающим из неспецифического расщепления генома Cas9 Streptococcus pyogenes (SpCas9), и идентифицировать варианты с более высокой точностью расщепления, данное изобретение описывает анализ на основе дрожжей, который позволяет одновременно оценивать активность в и вне мишени, направленную на две сконструированные геномные мишени. Скрининг вариантов SpCas9, полученных путем случайного мутагенеза домена Rec1-II, делал возможной идентификацию попаданий с увеличенными соотношениями в/вне мишени. Наиболее эффективную нуклеазу evoCas9 выделяли через комбинацию идентифицированных мутаций в одном варианте. Сравнительные анализы с использованием рационально сконструированных вариантов, о которых сообщали ранее, демонстрировали значительное усовершенствование точности evoCas9 по данному изобретению.