(11)	030619 (13) B1	Разделы: A B C E F G H
(21)	201190326
(22)	2010.06.08
(51)	A61K 38/48 (2006.01) C07K 14/46 (2006.01) C12N 9/64 (2006.01) C07K 14/61 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01) A61P 3/10 (2006.01) A61P 3/04 (2006.01) A61P 3/08 (2006.01) A61P 3/06 (2006.01) A61P 7/04 (2006.01) A61P 9/12 (2006.01) A61P 9/10 (2006.01) A61P 5/06 (2006.01) A61P 1/04 (2006.01) A61P 19/02 (2006.01) A61K 38/27 (2006.01) A61K 38/16 (2006.01) A61K 38/26 (2006.01) A61K 38/23 (2006.01) A61K 38/31 (2006.01) A61P 5/22 (2006.01) A61K 38/22 (2006.01) A61K 38/18 (2006.01) A61K 38/36 (2006.01)
(31)	61/185,112; 61/236,836; 61/280,955; 12/699,761; PCT/US2010/023106
(32)	2009.06.08; 2009.08.25; 2009.11.10; 2010.02.03; 2010.02.03
(33)	US
(43)	2012.06.29
(86)	PCT/US2010/037849
(87)	WO 2010/144502 2010.12.16
(71)	(73) АМУНИКС ОПЕРЕЙТИНГ ИНК. (US)
(72)	Шелленбергер Фолькер, Сильверман Джошуа, Стеммер Вилльям П., Ванг Чиа-Вей, Гитинг Натан, Клилэнд Джеффри Л., Спинк Бенджамин (US)
(74)	Поликарпов А.В. (RU)
(54)	ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ВКЛЮЧАЮЩИЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГОРМОНА РОСТА И XTEN, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

(57) 1. Гибридный белок, включающий одну или более последовательностей гормона роста (ГР), независимо выбранных из последовательности SEQ ID NO: 1 или последовательности, которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, где указанная последовательность ГР присоединена к одной или более последовательностям удлиненного рекомбинантного полипептида (XTEN) по меньшей мере из 200 аминокислотных остатков, где XTEN отличается тем, что:

(а) одна или более последовательностей XTEN включают по меньшей мере 200 смежных аминокислот, которые идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности сопоставимой длины, выбранной из SEQ ID NO: 63-79;

(б) одна или более последовательностей XTEN лишены предсказанного Т-клеточного эпитопа по данным анализа с применением алгоритма TEPITOPE, где предсказание алгоритма TEPITOPE относительно эпитопов внутри последовательности XTEN основано на величине балла -6 или более;

(в) имеет балл субпоследовательности, как определено в описании, менее чем 10;

(г) сумма остатков глицина (G), аланина (А), серина (S), треонина (Т), глутамата (Е) и пролина (Р) составляет более чем 90% от общего числа аминокислотных остатков XTEN;

где гибридный белок стимулирует продукцию IGF-1 у субъекта, имеет более продолжительный конечный период полувыведения при введении субъекту по сравнению с соответствующим ГР, не имеющим XTEN, при введении субъекту в сопоставимой молярной дозе, и

сродство связывания гибридного белка с рецептором гормона роста уменьшено по сравнению со сродством связывания соответствующего ГР, не имеющего XTEN.

2. Гибридный белок по п.1, включающий несколько последовательностей XTEN, где гибридный белок принимает множественные конфигурации XTEN, представляющие собой

3. Гибридный белок по п.1 или 2, где последовательности ГР и XTEN связаны через спейсерную последовательность, содержащую от 1 до 50 аминокислотных остатков.

4. Гибридный белок по п.3, где спейсерная последовательность включает расщепляемую последовательность.

5. Гибридный белок по п.1, где XTEN слит с гормоном роста по С- или N-концу гормона роста.

6. Гибридный белок по п.2, включающий XTEN, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 75, 76, 63 и 71.

7. Гибридный белок по п.1 или 2, включающий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 689, 695, 697, 757 и 791.

8. Гибридный белок по п.7, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 689, 695, 697, 757 и 791.

9. Гибридный белок по п.7, включающий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 757.

10. Гибридный белок по п.9, включающий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 757.

11. Гибридный белок по п.9, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 757.

12. Гибридный белок по п.1 или 2, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, идентичной по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794 и 796.

13. Гибридный белок по п.12, где нуклеиновая кислота выбрана из SEQ ID NO: 690, 696, 698, 758 и 792.

14. Гибридный белок по п.12, где нуклеиновая кислота представляет собой SEQ ID NO: 758.

15. Гибридный белок, включающий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 1 гормона роста человека, присоединенную к последовательности удлиненного рекомбинантного полипептида XTEN, идентичной по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 75, где гибридный белок стимулирует продукцию IGF-1 у субъекта, имеет более продолжительный конечный период полувыведения при введении субъекту по сравнению с соответствующим ГР, не имеющим XTEN, при введении субъекту в сопоставимой молярной дозе, и сродство связывания гибридного белка с рецептором гормона роста уменьшено по сравнению со сродством связывания соответствующего ГР, не имеющего XTEN.

16. Гибридный белок по п.15, где указанная последовательность XTEN идентична по меньшей мере на 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% последовательности SEQ ID NO: 75.

17. Гибридный белок по п.15, где указанная последовательность XTEN идентична по меньшей мере на 99% последовательности SEQ ID NO: 75.

18. Гибридный белок по п.15, где указанная последовательность XTEN включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75.

19. Гибридный белок по любому из пп.1-18, где сродство связывания уменьшено по меньшей мере в 10 раз.

20. Гибридный белок по любому из пп.1-18, отличающийся тем, что:

(1) когда меньшее молярное количество гибридного белка вводят субъекту по сравнению с соответствующим ГР, не имеющим XTEN, гибридный белок достигает сопоставимого терапевтического эффекта, что и соответствующий ГР, не имеющий XTEN; и

(2) когда гибридный белок вводят субъекту менее часто по сравнению с соответствующим ГР, не имеющим XTEN, который введен субъекту в ином эквивалентном молярном количестве, гибридный белок достигает сопоставимого терапевтического эффекта, что и соответствующий ГР, не имеющий XTEN.

21. Нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок по п.1 или 2, где нуклеиновая кислота по меньшей мере на 90% идентична последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794 и 796, или комплементарна ей.

22. Нуклеиновая кислота по п.21, которая идентична по меньшей мере на 90% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 690, 696, 698, 758 и 792.

23. Нуклеиновая кислота по п.22, которая идентична по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 758.

24. Нуклеиновая кислота по п.23, которая включает последовательность SEQ ID NO: 758.

25. Способ получения гибридного белка по любому из пп.1-20, включающего ГР, слитый с одним или более удлиненным рекомбинантным полипептидом XTEN, включающий:

(а) предоставление клетки-хозяина, включающей нуклеиновую кислоту по любому из пп.21-24;

(б) культивирование указанной клетки-хозяина при условиях, обеспечивающих экспрессию гибридного белка; и

(в) выделение гибридного белка.

26. Способ по п.25, где один или более XTEN экспрессируемого гибридного белка идентичны по меньшей мере на 90% последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 63-79.

27. Способ по п.25, где нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, идентична по меньшей мере на 90% последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842 и 844.

28. Способ по п.25, где нуклеиновая кислота представляет собой SEQ ID NO: 758.

29. Способ по п.25, где клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку.

30. Способ по п.25, где гибридный белок получают из цитоплазмы клетки-хозяина в растворимой форме.

31. Гибридный белок, полученный способом по п.25, где нуклеиновая кислота включает:

(1) последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ ID NO: 758;

(2) последовательность нуклеиновой кислоты, идентичную по меньшей мере на 95% последовательности SEQ ID NO: 758; или

(3) SEQ ID NO: 758.

32. Нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный белок по п.1 или 15, или комплементарная ей.

33. Экспрессионный вектор, включающий нуклеиновую кислоту по любому из пп.21-24 и 32.

34. Выделенная клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по любому из пп.21-24 и 32.

35. Применение гибридного белка по любому из пп.1-20 в производстве лекарственного средства для лечения дефицита гормона роста, синдрома Тернера, синдрома Прадера-Вилли, хронической почечной недостаточности, задержки внутриутробного развития, идиопатической низкорослости, истощения, связанного со СПИД, ожирения, рассеянного склероза, фибромиалгии, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, мышечной дистрофии, низкой мышечной массы и остеопороза, миокардиальной ишемии, низкой плотности костей.

36. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество гибридного белка по любому из пп.1-20 и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения дефицита гормона роста, синдрома Тернера, синдрома Прадера-Вилли, хронической почечной недостаточности, задержки внутриутробного развития, идиопатической низкорослости, истощения, связанного со СПИД, ожирения, рассеянного склероза, фибромиалгии, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, мышечной дистрофии, низкой мышечной массы и остеопороза, миокардиальной ишемии, низкой плотности костей.