(11)	021636 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	201200688
(22)	2010.11.04
(51)	C12N 1/14 (2006.01) C12N 9/14 (2006.01) C12N 9/24 (2006.01) C12N 9/42 (2006.01) C12N 15/52 (2006.01)
(31)	09174990.3
(32)	2009.11.04
(33)	EP
(43)	2012.12.28
(86)	PCT/EP2010/066796
(87)	WO 2011/054899 2011.05.12
(71)	(73) ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(72)	Лос Алрик Питер, Вонк Бренда, Берг Ван Ден Марко Александер, Дамвельд Роббертус Антониус, Сагт Корнелис Мария Якобус, Фоллебрехт Адрианус Вильхельмус Херманус, Схоневелд-Бергманс Маргот Элизабет Франсуаз (NL)
(74)	Воробьева Е.В. (RU)
(54)	ТРАНСФОРМАНТЫ TALAROMYCES

(57) 1. Способ получения трансформанта Talaromyces, включающий стадии:

(a) обеспечения одной или нескольких экспрессирующих кассет, способных продуцировать целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу, и содержащих один или несколько полинуклеотидов, кодирующих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу под контролем по меньшей мере одного промотора, способного направлять транскрипцию одного или нескольких полинуклеотидов в Talaromyces;

(b) обеспечения селективного маркера, включенного в одну или несколько экспрессирующих кассет (а) или включенного в другой полинуклеотид;

(c) трансфекции хозяина из Talaromyces одной или несколькими экспрессирующими кассетами из (а) и/или полинуклеотидом из (b);

(d) отбора трансформанта Talaromyces, который содержит два или более полинуклеотидов, кодирующих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу, и

(e) выделения трансформанта Talaromyces.

2. Трансформант Talaromyces, содержащий два или более рекомбинантных генов, способных экспрессировать целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу.

3. Трансформант Talaromyces по п.2, который способен продуцировать целлюлазу в отсутствие индуктора целлюлазы в среде с глюкозой, который имеет активность целлюлаз, равную 2 WSU/мл или больше в надосадочной жидкости или бульоне, разведенных в 16 раз или больше, полученный согласно способу по п.1.

4. Трансформант Talaromyces по п.3, который имеет активность целлюлаз 3 WSU/мл или больше или 5 WSU/мл или больше в надосадочной жидкости или бульоне, разведенных в 16 раз или больше.

5. Трансформант Talaromyces по любому из пп.3 или 4, который имеет активность эндоглюканаз, равную 50 WBCU/мл или больше.

6. Трансформанты Talaromyces по любому из пп.2-5, где два или большее количество генов, способных экспрессировать целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу, включают ген целлобиогидролазы, эндоглюканазы и/или β-глюкозидазы.

7. Трансформант Talaromyces по п.6, в котором ген целлобиогидролазы является целлобиогидролазой I и/или целлобиогидролазой II.

8. Трансформант Talaromyces по любому из пп.2-7, в котором два или несколько генов интегрированы в геном трансформанта Talaromyces.

9. Трансформант Talaromyces по любому из пп.2-8, в котором трансформант Talaromyces не содержит маркеров.

10. Способ получения полипептидной композиции, которая содержит одну или несколько целлюлаз, гемицеллюлаз и/или пектиназ, включающий стадии:

(a) обеспечения одной или нескольких экспрессирующих кассет, способных продуцировать один или несколько полипептидов и содержащих один или несколько полинуклеотидов, кодирующих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу под контролем по меньшей мере одного промотора, способного направлять транскрипцию одного или нескольких полинуклеотидов в Talaromyces;

(b) обеспечения селективного маркера, включенного в экспрессирующие кассеты (а) или включенного в другой полинуклеотид;

(c) трансфекции хозяина из Talaromyces одной или несколькими экспрессирующими кассетами из (а) и/или полинуклеотидом из (b);

(d) отбора трансформанта Talaromyces, который содержит два или более полинуклеотидов, кодирующих целлюлазу, гемицеллюлазу и/или пектиназу; и

(e) выработки полипептидной композиции культивированием трансформанта Talaromyces в подходящей культуральной среде, в которой индуктор целлюлазы фактически отсутствует; и

(f) необязательно, извлечения полипептидной композиции.

11. Способ по п.10, в котором в стадии (а) предусмотрены две или большее количество экспрессирующих кассет, три или большее количество экспрессирующих кассет или четыре или большее количество экспрессирующих кассет.

12. Способ по любому из пп.10 или 11, в котором промотор выбирают из группы, состоящей из промоторов glaA из A. niger и промоторов gpd из A. nidulans или их функциональных частей, перед которыми необязательно присутствуют вышерасположенные активирующие последовательности.

13. Способ по п.12, в котором перед промотором glaA из A, niger или его функциональной частью необязательно присутствует вышерасположенная активирующая последовательность.

14. Способ по любому из пп.10-13, в котором ген селективного маркера выбирают из группы, состоящей из amdS (ацетамидазы), hygB (гигромицин фосфотрансферазы) и ble (устойчивость к флеомицину), предпочтительно ble.

15. Полипептидная композиция, вырабатываемая трансформантом Talaromyces по любому из пп.2-9 и/или способом по любому из пп.10-14, где полипептидная композиция содержит СВН I, CBH II, EG и/или BG и имеет активность целлюлаз 2 WSU/мл или больше в надосадочной жидкости или бульоне, разведенных в 16 раз или больше.

16. Полипептидная композиция по п.15, содержащая СВН I, CBH II, EG и BG.

17. Полипептидная композиция по любому из пп.15-16, содержащая полипептид, выбранный из группы, включающей каталазу, лакказу, фенолоксидазу, оксидазу, оксидоредуктазы, ксиланазу, пероксидазу, липазу, гидролазу, эстеразу, кутиназу, протеазу и другие протеолитические полипептиды, аминопептидазу, карбоксипептидазу, фитазу, лиазу и другие пектинолитические ферменты, амилазу, глюкоамилазу, α-галактозидазу, β-галактозидазу, α-глюкозидазу, β-глюкозидазу, маннозидазу, изомеразу, инвертазу, трансферазу, рибонуклеазу, хитиназу, мутаназу и деоксирибонуклеазу.

18. Способ осахаривания лигноцеллюлозного материала, в котором лигноцеллюлозный материал, который необязательно предварительно обрабатывают, приводят в контакт с трансформантом Talaromyces по любому из пп.2-9; с полипептидной композицией по любому из пп.15-17, и в котором вырабатывается один или несколько сахаров.

19. Способ получения продукта ферментации, включая аминокислоты, витамины, лекарственные средства, добавки для животных кормов, химические продукты тонкого органического синтеза, химическое сырье, пластики, растворители, топливо или другие органические полимеры, молочную кислоту, этанол, топливный этанол или химические вещества, пластики, такие как, например, янтарная кислота и био(топливо), включая этанол, метанол, бутанол, синтетическое жидкое топливо и биогаз, где один или несколько сахаров, которые получены согласно способу по п.18, ферментируются ферментирующим микроорганизмом, предпочтительно дрожжами, с получением продукта ферментации.

20. Способ получения множественного трансформанта Talaromyces, в котором в первой трансформации по п.1 выделенный трансформант Talaromyces, выделенный на стадии (е) первой трансформации, используют в качестве хозяина Talaromyces и трансформируют во второй трансформации по п.1 и на стадии (е) второй трансформации выделяют множественный трансформант Talaromyces.

21. Способ по п.20, в котором в первой трансформации используют селективный маркер, который отличается от маркера второй трансформации.

22. Трансформант Talaromyces, имеющий общее содержание целлюлаз, определенное APEX, равное 38% или больше, 40% или больше и/или 45% или больше.