(11)	018116 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	201100724
(22)	2011.06.06
(51)	C07K 14/505 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01)
(43)	2012.12.28
(96)	2011000074 (RU) 2011.06.06
(71)	(73) ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ФОРТ" (ООО "ФОРТ") (RU)
(72)	Шереметьев Сергей Викторович, Коровкин Сергей Анатольевич, Катлинский Владимир Антонович, Катлинский Антон Викентьевич, Семченко Андрей Викторович (RU)
(74)	Айзина М.И. (RU)
(54)	СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОВАЛЕНТНОГО КОНЪЮГАТА ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ С ЭРИТРОПОЭТИНОМ

(57) 1. Способ получения монопегилированного эритропоэтина, отличающийся тем, что:

а) свободную гидроксильную группу монометоксиполиэтиленгликоля

где n - целое число в интервале от 455 до 1140, ацилируют хлор- или бромангидридом нитробензойной кислоты в безводном пиридине при температуре от 10 до 40°С и молярном соотношении хлорангидрида нитробензойной кислоты к монометоксиполиэтиленгликолю от 1:1 до 1000:1 с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты

где n принимает указанные выше значения,

который выделяют из реакционной массы осаждением С₄-С₈-простым эфиром или С₆-С₈-алканом;

б) нитрогруппу метоксиполиэтиленгликолевого эфира нитробензойной кислоты восстанавливают солью хрома(II) в водной или водно-органической среде с рН от 1,0 до 6,5 или в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от 10 до 40°С с получением метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты

где n принимает указанные выше значения,

который выделяют из реакционной массы осаждением C₄-С₈-простым эфиром или С₆-С₈-алканом;

в) метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С, молярном соотношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 10000:1 и молярном соотношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 3:1 до 10000:1 с последующим удалением избытка нитрита с получением активированного ПЭГ-агента;

г) активированный ПЭГ-агент вводят в реакцию азосочетания с эритропоэтином в водной или водно-органической среде с рН от 7,0 до 10,0 при температуре от 0 до 30°С, по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей с получением смеси монопегилированного, дипегилированного и немодифицированного эритропоэтина и блокированного ПЭГ-агента;

д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с получением монопегилированного эритропоэтина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии а) ацилирование проводят при комнатной температуре и для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что на стадии б) для создания и поддержания рН применяют ацетатный буферный раствор, в качестве восстановителя применяют CrSO₄, а для осаждения продукта применяют диэтиловый эфир.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что на стадии в) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой.

5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что на стадии в) диазотирование проводят трет-бутилнитритом в присутствии HCl в тетрагидрофуране.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на стадии г) поддерживают рН реакционной смеси равным 9,5±0,3, степень превращения эритропоэтина составляет 80-85%, а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют тирозин.

7. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что на стадии г) поддерживают рН реакционной смеси 7,0±0,3, степень превращения эритропоэтина составляет 70-75%, а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют гистидин.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что на стадии д) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М NaCl.