(11)	018012 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	200971119
(22)	2008.06.09
(51)	C12N 15/82 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
(31)	07075460.1; 60/934,431; 07075485.8
(32)	2007.06.11; 2007.06.13; 2007.06.18
(33)	EP; US; EP
(43)	2010.04.30
(86)	PCT/EP2008/004652
(87)	WO 2008/151780 2008.12.18
(71)	(73) БАЙЕР КРОПСАЙЕНС Н.В. (BE)
(72)	Тролиндер Линда (US), Мунс Софи, Хабекс Верле, Палинк Димитри, Бергхман Эвелин (BE)
(74)	Медведев В.Н. (RU)
(54)	УСТОЙЧИВЫЕ К НАСЕКОМЫМ РАСТЕНИЯ ХЛОПЧАТНИКА И МЕТОДЫ ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ

(57) 1. Способ идентификации присутствия в биологических образцах чужеродной ДНК, содержащей кодирующую последовательность гена модифицированного cry2Ae, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы Rubisco, под контролем промотора 35S Cauliflower Mosaic Virus, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям, представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, при этом способ включает амплификацию фрагмента ДНК размером 100-500 пн из нуклеиновой кислоты, представленной в указанных биологических образцах, с использованием полимеразной цепной реакции по крайней мере с двумя праймерами, один из которых распознает указанную 5'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, или указанную 3'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность комплементарную SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, другой праймер из указанных праймеров, распознает последовательность внутри чужеродной ДНК, имеет последовательность комплементарную SEQ ID No. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112, и анализ присутствия характерной последовательности ДНК, которая содержит часть указанной чужеродной ДНК и часть указанных непосредственно фланкирующих ее 5'- и 3'-прилегающих областей.

2. Способ по п.1, где указанный праймер, распознающий 5'-прилегающую область, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 11 от позиции 1 до позиции 463, или указанный праймер, распознающий 3'-прилегающую область, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 141 или SEQ ID No. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112.

3. Способ по п.1, где указанный праймер, распознающий 5'-прилегающую область, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или указанный праймер, распознающий 3'-прилегающую область, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной SEQ ID No. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192 или нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438.

4. Способ по п.3, где указанные праймеры содержат последовательности SEQ ID No. 3 и SEQ ID No. 4, соответственно, или последовательности SEQ ID No. 5 и SEQ ID No. 7, соответственно.

5. Способ по п.4, где способ включает амплификацию фрагмента примерно 189 или 197 пн с использованием протокола ПЦР идентификации указанной чужеродной ДНК, фланкированной 5'- и 3'-прилегающими областями.

6. Набор для идентификации присутствия в биологических образцах чужеродной ДНК, содержащей кодирующую последовательность гена модифицированного cry2Ae, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы Rubisco, под контролем промотора 35S Cauliflower Mosaic Virus, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированых в АТСС под номером РТА-8398, при этом набор включает один праймер, распознающий указанную 5'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, или один праймер, распознающий указанную 3'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность комплементарную SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и один праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, где указанная чужеродная ДНК имеет нуклеотидную последовательность комплементарную SEQ ID No. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112.

7. Набор по п.6, где указанный праймер, распознающий 5'-прилегающую область, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 11 от позиции 1 до позиции 463, или указанный праймер, распознающий 3'-прилегающую область, состоящую из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, состоит из нуклеотидной последовательности 17-200 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 141 или SEQ ID No. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112.

8. Набор по п.6, где указанный праймер, распознающий 5'-прилегающую область, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140 или нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 11 от позиции 1 до позиции 463, или указанный праймер, распознающий 3'-прилегающую область, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, и указанный праймер, распознающий последовательность внутри чужеродной ДНК, содержит на его 3'-конце нуклеотидную последовательность по крайней мере из 17 последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидной последовательности комплементарной SEQ ID No. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192 или нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112.

9. Набор по п.6, включающий праймер, содержащий последовательность SEQ ID No. 4, и праймер, содержащий последовательность SEQ ID No. 3, или включающий праймер, содержащий последовательность SEQ ID No. 5, и праймер, содержащий последовательность SEQ ID No. 7.

10. Способ скрининга семян на наличие чужеродной ДНК, содержащей кодирующую последовательность гена модифицированного cry2Ae, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы Rubisco, под контролем промотора 35S Cauliflower Mosaic Virus, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, при этом способ включает определение последовательности ДНК, специфичной для указанной чужеродной ДНК, фланкированной по 5'- и 3'-прилегающим областям, со специфическими праймером, который специфически распознают указанную 5'- или 3'-прилегающую область, в партиях образцов семян после амплификации фрагмента ДНК между 100 и 500 пн из нуклеиновой кислоты, представленной в указанных образцах семян, используя полимеразную цепную реакцию с применением по меньшей мере двух праймеров, где один из указанных праймеров распознает 5'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида в позиции 1 до нуклеотида в позиции 140 или нуклеотидной последовательности SEQ ID No. 11 от нуклеотида в позиции 1 до нуклеотида в позиции 463, или 3'-прилегающую область, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида в позиции 113 до нуклеотида в позиции 438, а другой праймер из указанных праймеров распознает последовательность внутри чужеродной ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности SEQ ID No.1 от нуклеотида в позиции 141 до нуклеотида в позиции 192 или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 от позиции 1 до позиции 112.

11. Способ определения зиготности растений, растительного материала или семян, содержащих чужеродную ДНК, содержащую кодирующую последовательность гена модифицированного cry2Ae, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы Rubisco, под контролем промотора 35S Cauliflower Mosaic Virus, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, при этом способ включает амплификацию фрагментов ДНК 100-500 пн из нуклеиновой кислоты, представленной в указанных биологических образцах с использованием полимеразной цепной реакции по крайней мере с тремя праймерами, два из указанных праймеров специфически распознают растительную ДНК перед вставкой, такой как 5'-прилегающую область указанного элитного результата, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от позиции 1 до позиции 463, или 3'-прилегающую область указанного элитного результата, где указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, или ДНК перед вставкой, имеющую нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 10 или комплементарную ей, третий из указанных праймеров распознает последовательность внутри чужеродной ДНК, имеющую нуклеотидную последовательность комплементарную SEQ ID No. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 192 или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 от нуклеотида 1 до нуклеотида 112, и анализ присутствия характерной последовательности ДНК, которая содержит часть указанной чужеродной ДНК и часть указанных непосредственно фланкирующих ее 5'- и 3'-прилегающих областей.

12. Способ определения наличия в биологических образцах чужеродной ДНК, содержащей кодирующую последовательность гена модифицированного cry2Ae, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы Rubisco, под контролем промотора 35S Cauliflower Mosaic Virus, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, посредством гибридизации с комплементарно меченым зондом нуклеиновой кислоты, в котором соотношение зонд:целевая нуклеиновая кислота амплифицировано посредством рециклинга целевой последовательности нуклеиновой кислоты, где указанный способ включает:

a) гибридизацию указанной целевой последовательности нуклеиновой кислоты с первым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 141 до нуклеотида 158 или комплементарную ей, или с указанным первым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 от нуклеотида 95 до нуклеотида 112 или комплементарную ей;

b) гибридизацию указанной целевой последовательности нуклеиновой кислоты со вторым олигонуклеотидом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 123 до нуклеотида 140 или комплементарную ей, или указанным меченым зондом нуклеиновой кислоты, включающим нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 130 или комплементарную ей, где указанные первый и второй олигонуклеотиды перекрываются по крайней мере на один нуклеотид, и где или первый, или второй указанный олигонуклеотид является меченым и является указанным меченым зондом;

c) расщепление только меченого зонда внутри дуплекса зондщелевая последовательность нуклеиновой кислоты с помощью фермента, который вызывает селективное расщепление зонда, приводящее к диссоциации дуплекса, оставляющей целевую последовательность интактной;

d) рециклинг целевой последовательности нуклеиновой кислоты повторением стадий (а)-(с) и

е) детекция расщепленного меченого зонда и, таким образом, определение наличия названной целевой последовательности нуклеиновой кислоты.

13. Трансгенное растение хлопчатника, или клетки, части, его семя или потомство, где каждый из них содержит в своем геноме чужеродную ДНК, содержащую кодирующую последовательность гена модифицированного cry2Ae, функционально связанного с транзитным пептидом малой субъединицы Rubisco, под контролем промотора 35S Cauliflower Mosaic Virus, где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 5'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, где указанная 5'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 1 от нуклеотида 1 до нуклеотида 140, или нуклеотидную последовательность SEQ ID No. 11 от нуклеотида 1 до нуклеотида 463, и где указанная чужеродная ДНК непосредственно фланкирована по 3'-прилегающей к указанной чужеродной ДНК области, указанная 3'-прилегающая область имеет нуклеотидную последовательность комплементарную последовательности SEQ ID No. 2 от нуклеотида 113 до нуклеотида 438, где указанная чужеродная ДНК, фланкированная по 5'- и 3'-прилегающим областям представлена в эталонных семенах, депонированных в АТСС под номером РТА-8398, геномная ДНК которых при анализе с применением протокола для идентификации указанной чужеродной ДНК, фланкированной по указанным 5'- и 3'-прилегающим областям, с двумя праймерами, включающими нуклеотидные последовательности SEQ ID No. 3 и SEQ ID No. 4 соответственно, дает фрагмент ДНК примерно 189 пн.