(57) 1. Способ получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК у прокариот, включающий в себя стадии:
a) получения первичной прокариотической клетки, содержащей внехромосомную реципиентную молекулу ДНК, содержащую первую последовательность ДНК для рекомбинации и способную автономно реплицироваться в прокариотической клетке, и внехромосомную донорную молекулу ДНК, содержащую вторую последовательность ДНК для рекомбинации и, по меньшей мере, первую маркерную последовательность, кодирующую генный продукт и не способную к автономной репликации в прокариотической клетке,
b) культивирования первичной прокариотической клетки в селективных условиях, стимулирующих образование коинтеграта или гибридной молекулы между реципиентной и донорной молекулами ДНК, и рекомбинацию этих двух последовательностей ДНК для рекомбинации, и позволяющих рост и/или размножение клеток только в том случае, если экспрессирован генный продукт первой маркерной последовательности, и
c) выделения вторичной прокариотической клетки, растущей и/или размножающейся в селективных условиях и содержащей гибридную молекулу ДНК, по меньшей мере, с первой маркерной последовательностью и образованной из первой и второй последовательностей рекомбинантной последовательности ДНК, полученной вследствие рекомбинации между первой и второй последовательностями ДНК,
где прокариотическая клетка транзиторно или постоянно дефицитна по системе репарации ошибочного спаривания и
где донорная молекула ДНК и реципиентная молекула ДНК являются отличными друг от друга линейными или кольцевыми плазмидами.
2. Способ по п.1, где донорная молекула ДНК не имеет участка инициации репликации.
3. Способ по п.1, где донорная молекула ДНК имеет нефункциональный участок инициации репликации.
4. Способ по любому из пп.1-3, где донорная молекула ДНК представляет собой плазмиду Bacillus subtilis, не способную реплицироваться в Е. coli.
5. Способ по п.4, где донорная молекула ДНК представляет собой плазмиду В. subtilis pMIX91, содержащую маркер specR и маркер phleoR, или плазмиду В. subtilis pMIX101, содержащую маркер tcR.
6. Способ по любому из пп.1-5, где первая маркерная последовательность структуры донорной ДНК выбрана из группы, состоящей из пищевого маркера, маркера устойчивости к антибиотику и последовательности, кодирующей субъединицу фермента.
7. Способ по п.6, где генный продукт первой маркерной последовательности обеспечивает устойчивость к антибиотику клетки, чувствительной к этому антибиотику.
8. Способ по п.6 или 7, где первая маркерная последовательность представляет собой specR, генный продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к спектиномицину, или phleoR, генный продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к флеомицину, или tcR, генный продукт которого обеспечивает устойчивость клетки к тетрациклину.
9. Способ получения и детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК у прокариот, включающий в себя стадии:
d) получения первичной прокариотической клетки, содержащей внехромосомную реципиентную молекулу ДНК, содержащую первую последовательность ДНК для рекомбинации и способную автономно реплицироваться в прокариотической клетке, и внехромосомную донорную молекулу ДНК, содержащую вторую последовательность ДНК для рекомбинации и, по меньшей мере, первую маркерную последовательность, кодирующую генный продукт и не способную к автономной репликации в прокариотической клетке,
e) культивирования первичных прокариотических клеток в селективных условиях, стимулирующих образование коинтеграта или гибридной молекулы между реципиентной и донорной молекулами ДНК и рекомбинацию двух последовательностей ДНК для рекомбинации и позволяющих рост и/или размножение клеток только в том случае, если экспрессирован генный продукт первой маркерной последовательности, и
f) выделения вторичных прокариотических клеток, растущих и/или размножающихся в селективных условиях и содержащих гибридную молекулу ДНК, по меньшей мере, с первой маркерной последовательностью и образованной из первой и второй последовательностей рекомбинантной последовательности ДНК, полученной вследствие рекомбинации между первой и второй последовательностями ДНК,
где донорная молекула ДНК представляет собой плазмиду В. subtilis pMIX91, содержащую маркер specR и маркер phleoR, или плазмиду В. subtilis pMIX101, содержащую маркер tcR.
10. Способ по п.9, где реципиентная молекула ДНК является линейной или кольцевой структурой ДНК, в частности плазмидой или бактериофагом.
11. Способ по п.9 или 10, где прокариотическая клетка имеет функциональную систему репарации ошибочного спаривания.
12. Способ по п.9 или 10, где прокариотическая клетка транзиторно или постоянно дефицитна по системе репарации ошибочного спаривания.
13. Способ по любому из пп.1-12, где реципиентная молекула ДНК представляет собой плазмиду, способную реплицироваться в Escherichia coli.
14. Способ по п.13, где реципиентная молекула ДНК представляет собой плазмиду Е. coli pACYC184, или плазмиду Е. coli pMIX100, или их производное.
15. Способ по любому из пп.1-14, где донорная молекула ДНК и/или ее участок инициации репликации происходят из вида прокариота, отличного от прокариотического вида, в клетки которого вводят молекулу донорной ДНК.
16. Способ по любому из пп.1-15, где функционирование участка инициации репликации донорной ДНК нарушено мутацией.
17. Способ по любому из пп.1-16, где донорная молекула ДНК содержит вторую маркерную последовательность.
18. Способ по любому из пп.1-17, где реципиентная молекула ДНК содержит третью маркерную последовательность и, необязательно, четвертую маркерную последовательность.
19. Способ по п.17 или 18, где вторая, третья и четвертая маркерные последовательности представляют собой кодирующие или не кодирующие белки последовательности, выбранные из группы, состоящей из пищевых маркеров, пигментных маркеров, маркеров устойчивости к антибиотикам, маркеров чувствительности к антибиотикам, участков распознавания ферментов рестрикции, участков распознавания праймеров и последовательностей, кодирующих субъединицу фермента.
20. Способ по п.19, где генные продукты третьей и четвертой маркерных последовательностей реципиентной молекулы ДНК обеспечивают устойчивость к антибиотику клетки, которая чувствительна к этому антибиотику.
21. Способ по п.20, где генный продукт третьей маркерной последовательности обеспечивает устойчивость к тетрациклину.
22. Способ по п.20, где генный продукт четвертой маркерной последовательности обеспечивает устойчивость клетки к хлорамфениколу.
23. Способ по любому из пп.1-22, где первая и вторая последовательности ДНК для рекомбинации отличаются по меньшей мере двумя нуклеотидами.
24. Способ по любому из пп.1-23, где первая и вторая последовательности ДНК для рекомбинации являются встречающимися в природе последовательностями.
25. Способ по п.24, где первая и/или вторая последовательности ДНК для рекомбинации происходят из вирусов, бактерий, растений, животных и/или человеческих существ.
26. Способ по любому из пп.1-25, где первая и/или вторая последовательности ДНК для рекомбинации являются искусственными последовательностями.
27. Способ по любому из пп.1-26, где каждая из первой и второй последовательностей ДНК для рекомбинации содержит одну или несколько кодирующих белок последовательностей и/или одну или несколько некодирующих последовательностей.
28. Способ по любому из пп.1-27, где первичную прокариотическую клетку получают посредством одновременного или последовательного введения в прокариотическую клетку молекулы реципиентной ДНК и молекулы донорной ДНК.
29. Способ по п.28, где молекулы реципиентной и донорной ДНК вводят в прокариотическую клетку посредством трансформации, конъюгации, трансдукции, сексдукции и/или электропорации.
30. Способ по любому из пп.1-29, где первичную прокариотическую клетку культивируют в присутствии по меньшей мере одного антибиотика, к которому генный продукт первой маркерной последовательности обеспечивает устойчивость.
31. Способ по п.30, где первичную прокариотическую клетку дополнительно культивируют в присутствии второго, третьего и/или четвертого антибиотиков, к которым генные продукты второй маркерной последовательности, третьей маркерной последовательности и четвертой маркерной последовательности, соответственно, обеспечивают устойчивость.
32. Способ по любому из пп.1-31, где прокариотическая клетка представляет собой клетку архебактерии или эубактерии.
33. Способ по п.32, где эубактерия представляет собой грамотрицательную бактерию, грамположительную бактерию или цианобактерию.
34. Способ по п.33, где грамотрицательная бактерия представляет собой Escherichia coli.
35. Способ по пп.1-8 и 12, где транзиторный или постоянный дефицит системы репарации ошибочного спаривания происходит вследствие мутации, делеции и/или индуцируемой экспрессии или репрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в систему репарации ошибочного спаривания, обработки средством, насыщающим систему репарации ошибочного спаривания, и/или обработки средством, глобально нокаутирующим репарацию ошибочного спаривания.
36. Способ по пп.1-8, 12 и 35, где прокариотическая клетка несет мутантный ген mutS и/или мутантный ген mutL.
37. Способ по любому из пп.1-36, где первую и вторую рекомбинантные последовательности ДНК, содержащиеся в гибридной молекуле ДНК вторичной прокариотической клетки, отбирают, и/или выделяют, и/или анализируют.
38. Способ по п.37, где первую и вторую рекомбинантные последовательности ДНК выделяют посредством расщепления рестрикционными ферментами.
39. Способ по п.37, где первую и вторую рекомбинантные последовательности ДНК амплифицируют посредством ПЦР.
40. Способ по любому из пп.37-39, где выделенные первую и вторую рекомбинантные последовательности ДНК вставляют в донорную молекулу ДНК и реципиентную молекулу ДНК, соответственно, и подвергают другому циклу рекомбинации.
41. Применение плазмид В. subtilis pMIX91 и pMIX101 в качестве донорных молекул ДНК в способе по любому из пп.1-40 для получения и/или детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК в прокариотической клетке-хозяине, предпочтительно в клетке Е. coli.
42. Применение плазмид Е. coli pACYC184 или pMIX100 или их производных в качестве реципиентной молекулы ДНК в способе по любому из пп.1-40 для получения и/или детектирования рекомбинантных последовательностей ДНК в прокариотической клетке-хозяине, предпочтительно в клетке Е. coli.
43. Способ получения в прокариотической клетке гибридного гена и/или кодируемого гибридным геном белка, где осуществляют способ по любому из пп.1-40, и в прокариотической клетке получают гибридный ген или кодируемый гибридным геном белок, и гибридный ген и/или кодируемый белок отбирают в прокариотической клетке и/или выделяют из нее после экспрессии.
| 
