(57) 1. Составной полипептид, содержащий исходный полипептид и домен, усиливающий экспрессию (EED), где упомянутый EED содержит такие первый и второй цистеиновые аминокислотные остатки Cys1 и Cys2, что Cys1 располагается ближе к N-концу молекулы составного полипептида, чем Cys2, в котором Cys1 и Cys2 разделены полипептидным линкером, причем упомянутый линкер
свободен от цистеина и пролина;
определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Cys1 и Cys2 соединяться внутримолекулярной дисульфидной связью друг с другом;
имеет гибкую полипептидную конформацию, по существу, свободную от вторичной полипептидной структуры в водном растворе, в котором по крайней мере один из Cys1 и Cys2 дериватизируется с помощью дериватизирующего компонента и в котором исходный полипептид является антителом.
2. Составной полипептид по п.1, в котором по крайней мере 75% аминокислотных остатков в линкере выбирают из Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met, Tyr, Asn и Gln.
3. Составной полипептид по п.1 или 2, в котором составной полипептид является одноцепочным полипептидом.
4. Составной полипептид по любому из пп.1-3, в котором EED располагается на C- или N-конце составного полипептида.
5. Составной полипептид по любому из пп.1-4, в котором EED находится в виде
-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m,
где n является любым целым числом от 2 до 20;
m является 0 или 1 и
Xaa допускается в каждой позиции как Gly, Ala, Thr или Ser.
6. Составной полипептид по п.5, в котором n=4, а (Xaa)4 является (Gly)4, (Gly)3Ser, (Gly)2SerGly, GlySer(Gly)2 или Gly(Ser)3.
7. Составной полипептид по п.5, в котором n=5, а (Xaa)5 является (Gly)5, (Gly)4Ser, (Gly)3SerGly, (Gly)2Ser(Gly)2, GlySer(Gly)3 или Ser(Gly)4.
8. Составной полипептид по любому из пп.5-7, в котором EED находится в виде
-His-His-His-His-His-His-Cys1-(Xaa)n-Cys2-(Pro)m или
-Cys1-(Xaa)n-Cys2-His-His-His-His-His-His-(Pro)m.
9. Составной полипептид по любому из пп.1-8, в котором дериватизированный Cys1 и/или Cys2 является продуктом реакции остатка/остатков Cys1 и/или Cys2 с дериватизирующим компонентом, содержащим малеимидную группу, сульфгидрильную группу или пиридил-дисульфидную группу.
10. Составной полипептид по п.9, в котором дериватизирующий компонент, содержащий малеимидную группу, выбирают из PEG-малеимида («PEG-MAL»), малеимид-функционализированного флуоресцентного маркера, малеимид-функционализированного маркера аналитического обнаружения, малеимид-функционализированного радиоактивного индикатора или малеимид-функционализированного белкового сшивателя.
11. Составной полипептид по п.10, в котором PEG-MAL выбирают из
метокси-PEG-MAL 5 кДа;
метокси-PEG-MAL 20 кДа;
метокси-PEG-MAL 40 кДа;
метокси-PEG-MAL2 5 кДа;
метокси-PEG-MAL2 20 кДа;
метокси-PEG-MAL2 40 кДа
или их любых сочетаний.
12. Составной полипептид по п.9, в котором Cys1 или Cys2 дериватизируют с помощью дериватизирующего компонента, содержащего 5-тио-2-нитробензойную кислотную («TNB-тиол») группу или сульфгидрильную группу, причем, в частности, упомянутый дериватизирующий компонент является Cys2, соединенной с Cys1 дисульфидной связью.
13. Составной полипептид по любому из пп.1-12, в котором как Cys1, так и Cys2 дериватизируют с помощью дериватизирующего компонента.
14. Составной полипептид по любому из пп.1-12, в котором Cys1 или Cys2 дериватизируют с помощью первого дериватизирующего компонента, а соответствующую другую Cys2 или Cys1 соответственно дериватизируют с помощью второго дериватизирующего компонента.
15. Составной полипептид по п.14, в котором второй дериватизирующий компонент является этилмалеимидом.
16. Составной полипептид по любому из пп.1-15, в котором упомянутое антитело выбирают из моноспецифичного одноцепочного антитела или биспецифичного одноцепочного антитела.
17. Составной полипептид по п.16, в котором биспецифичное одноцепочное антитело содержит первую часть, специфично связывающуюся с антигеном-эффектором, и вторую часть, специфично связывающуюся с антигеном-мишенью.
18. Составной полипептид по п.17, в котором антиген-эффектор выбирают из человеческого антигена CD3, человеческого антигена CD64, человеческого антигена CD89 и человеческого антигена NKG2D.
19. Составной полипептид по п.17 или 18, в котором антиген-мишень выбирают из EpCAM, CCR5, CD19, HER-2 neu, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (муцин), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, hCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, ганглиозида GD3, 9-0-ацетила-GD3, GM2, Globo H, фукозила GM1, Poly SA, GD2, карбоангидразы IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue-1, Plasma Cell Antigen, (мембранно-связанного) IgE, MCSP (Melanoma Chrondroitin Sulfate Proteoglycan), CCR8, предшественника TNF-a, STEAP, мезотелина, антигена А33, PSCA (Prostate Stem Cell Antigen), Ly-6, десмоглеина 4, E-cadherin neoepitope, Fetal Acetilcholine Receptor, CD25, маркера CA19-9, маркера CA-125 и MIS (Muellerian Inhibitory Substance) Receptor type II, sTn (сиалилированного антигена Tn; TAG-72), FAP (Fibroblast Activation Antigen), эндосиалина, EGFRvIII, LG, SAS и CD63 и в котором все упомянутые антигены являются человеческими антигенами.
20. Композиция, содержащая составной полипептид по любому из предшествующих пунктов и приемлемый в фармакологии носитель.
21. Способ получения составного полипептида по любому из пп.1-19, в котором составной полипептид содержит исходный полипептид и экспрессируется с большим выходом, чем исходный полипептид, причем упомянутый способ содержит:
A) обеспечение нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный полипептид;
B) введение в любой конец нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный полипептид, нуклеотидной последовательности, кодирующей домен, усиливающий экспрессию (EED), причем упомянутая нуклеотидная последовательность, кодирующая EED, содержит кодоны для первого и второго цистеиновых аминокислотных остатков Cys1 и Cys2 соответственно, при этом кодон для Cys1 располагается ближе к 5'-концу нуклеотидной последовательности, чем кодон для Cys2, в которой кодоны для Cys1 и Cys2 разделяются нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидный линкер, причем упомянутый линкер свободен от цистеина и определяет длину, достаточную для того, чтобы позволить Cys1 и Cys2 вступать во внутримолекулярную дисульфидную связь друг с другом;
C) трансфекция нуклеотидной последовательности из этапа В в систему экспрессии хозяина в соответствующем векторе;
D) инкубирование системы экспрессии хозяина при соответствующих условиях, чтобы иметь результатом экспрессию нуклеотидной последовательности из этапа В;
E) выделение полипептида, экспрессированного на этапе D, чтобы получить составной полипептид.
22. Способ по п.21, содержащий дополнительный этап дериватизации составного полипептида, полученного на этапе E при Cys1 и/или Cys2.
|
