(57) 1. Применение биспецифического антитела для лечения или уменьшения интенсивности B-клеточного рака у субъекта, причем биспецифическое антитело содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывает человеческий CD3, второй антигенсвязывающий домен, который связывает человеческий CD20, и химерный Fc-домен, связанный с каждым из первого и второго антигенсвязывающих доменов, где химерный Fc-домен включает от N-конца к C-концу домен CH1 человеческого IgG1 или человеческого IgG4; шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54; домен CH2 человеческого IgG4 и домен CH3 человеческого IgG1 или человеческого IgG4,
причем первый антигенсвязывающий домен (А1), который связывает человеческий CD3, содержит три определяющих комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три определяющих комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), причем
(a) A1-HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;
(b) A1-HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;
(c) A1-HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
(d) A1-LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
(e) A1-LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и
(f) A1-LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,
причем второй антигенсвязывающий домен (А2), который специфически связывает человеческий CD20, содержит три определяющих комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три определяющих комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), причем
(g) A2-HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
(h) A2-HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
(i) A2-HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
(j) A2-LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
(k) A2-LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и
(l) A2-LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и
где биспецифическое антитело проявляет более высокую аффинность связывания с человеческим FcgRIIA по отношению к человеческому FcgRIIB и проявляет мало или вообще не проявляет поддающуюся детекции аффинность связывания с человеческим FcgRI и человеческим FcgRIII, как измерено в анализе поверхностного плазмонного резонанса.
2. Применение биспецифического антитела в производстве медикамента для лечения или уменьшения интенсивности B-клеточного рака у субъекта, причем биспецифическое антитело содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывает человеческий CD3, второй антигенсвязывающий домен, который связывает человеческий CD20, и химерный Fc-домен, связанный с каждым из первого и второго антигенсвязывающих доменов, где химерный Fc-домен включает от N-конца к C-концу домен CH1 человеческого IgG1 или человеческого IgG4; шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54; домен CH2 человеческого IgG4 и домен CH3 человеческого IgG1 или человеческого IgG4,
причем первый антигенсвязывающий домен (А1), который связывает человеческий CD3, содержит три определяющих комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три определяющих комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), причем
(a) A1-HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;
(b) A1-HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;
(c) A1-HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
(d) A1-LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
(e) A1-LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и
(f) A1-LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,
причем второй антигенсвязывающий домен (А2), который специфически связывает человеческий CD20, содержит три определяющих комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три определяющих комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), причем
(g) A2-HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
(h) A2-HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
(i) A2-HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
(j) A2-LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
(k) A2-LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и
(1) A2-LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и
где биспецифическое антитело проявляет более высокую аффинность связывания с человеческим FcgRIIA по отношению к человеческому FcgRIIB и проявляет мало или вообще не проявляет поддающуюся детекции аффинность связывания с человеческим FcgRI и человеческим FcgRIII, как измерено в анализе поверхностного плазмонного резонанса.
3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что B-клеточный рак выбран из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, B-клеточной лимфобластной лимфомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомы, лейкоза ворсистых клеток и лимфомы Беркитта.
4. Применение по п.3, в котором B-клеточный рак представляет собой неходжкинскую лимфому.
5. Применение по п.3, в котором B-клеточный рак представляет собой фолликулярную лимфому.
6. Применение по п.3, в котором B-клеточный рак представляет собой диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому.
7. Применение по п.3, в котором B-клеточный рак представляет собой мантийноклеточную лимфому.
8. Применение по п.3, в котором B-клеточный рак представляет собой лимфому маргинальной зоны.
9. Применение по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что субъект поражен опухолью, которая устойчива или не полностью восприимчива к (a) анти-CD20 моноспецифической терапии отдельно или (b) монотерапии ритуксимабом.
10. Применение по любому из пп.1-9, отличающееся тем, что субъект получал терапию анти-CD20 моноспецифическим антителом по меньшей мере от 1 дня до 1 года перед введением биспецифического антитела.
11. Применение по любому из пп.1-10, отличающееся тем, что антитело:
(a) демонстрирует сниженную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) по сравнению с антителом, содержащим Fc-домен дикого типа, согласно данным in vitro анализа цитотоксичности;
(b) демонстрирует незначительную или не демонстрирует выявляемую ADCC;
(c) демонстрирует сниженную комплементзависимую цитотоксичность (CDC) по сравнению с антителом, содержащим Fc-домен дикого типа, согласно данным in vitro анализа цитотоксичности;
(d) демонстрирует менее чем 50%-ную цитотоксичность согласно данным по клеточному лизису, полученным в in vitro анализе;
(e) демонстрирует незначительную или не демонстрирует выявляемую CDC;
(f) индуцирует снижение опосредованного T-клетками уничтожения клеток, несущих Fc-рецепторы, таких как NK-клетки или макрофаги, по сравнению с антителом, содержащим Fc-домен дикого типа; или
(g) индуцирует снижение уничтожения T-клеток, опосредованного клетками, несущими Fc-рецепторы, такими как NK-клетки или макрофаги, по сравнению с антителом, содержащим Fc-домен дикого типа.
12. Применение по любому из пп.1-11, отличающееся тем, что первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывает человеческий CD3, содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), включающую SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR), включающую SEQ ID NO: 18.
13. Применение по любому из пп.1-12, отличающееся тем, что второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывает человеческий CD20, содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), включающую SEQ ID NO: 2, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR), включающую SEQ ID NO: 18.
14. Применение по любому из пп.1-13, отличающееся тем, что биспецифическое антитело содержит химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
15. Применение по любому из пп.1-13, отличающееся тем, что биспецифическое антитело содержит химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
16. Применение по любому из пп.1-13, отличающееся тем, что биспецифическое антитело содержит химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
17. Применение по любому из пп.1-13, отличающееся тем, что биспецифическое антитело содержит химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
18. Применение по любому из пп.1-13, отличающееся тем, что биспецифическое антитело содержит химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, связанный с первым антигенсвязывающим доменом, и химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, связанный со вторым антигенсвязывающим доменом.
19. Применение по любому из пп.1-13, отличающееся тем, что биспецифическое антитело содержит химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, связанный с первым антигенсвязывающим доменом, и химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, связанный со вторым антигенсвязывающим доменом.
20. Способ получения биспецифического антитела для использования в лечении B-клеточного рака у субъекта, включающий:
a) трансфицирование клетки-хозяина (i) молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела, причем молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую LCVR, содержащую SEQ ID NO: 18, и нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческую константную CL-область Ig, при этом указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая область LCVR антитела, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей CL-область Ig;
b) трансфицирование клетки-хозяина с этапа (a) (i) молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей первую тяжелую цепь указанного антитела, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую HCVR, содержащую SEQ ID NO: 10, и нуклеотидную последовательность, кодирующую химерную C_H-область IgG, причем нуклеотидна последовательность, кодирующая C_H-область, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 32, при этом указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая HCVR, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей C_H-область; и (ii) молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей вторую тяжелую цепь указанного антитела, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую HCVR, содержащую SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, кодирующую химерную C_H-область IgG, при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая C_H-область, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 32, при этом указанная нуклеотидная последовательность, кодирующая HCVR, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей C_H-область; и
c) получения антитела путем совместной экспрессии молекул нуклеиновых кислот согласно (a) и (b) в указанной клетке-хозяине,
где биспецифическое антитело проявляет более высокую аффинность связывания с человеческим FcgRIIA по отношению к человеческому FcgRIIB и проявляет мало или вообще не проявляет аффинность связывания с человеческим FcgRI и человеческим FcgRIII, как измерено в анализе поверхностного плазмонного резонанса.
21. Способ по п.20, дополнительно включающий этапы культивирования клетки-хозяина этапа (b), причем антитело секретируется в клеточную культуральную среду; и выделение антитела из клеточной культуральной среды.
22. Способ лечения или уменьшения интенсивности B-клеточного рака у субъекта, включающий введение биспецифического антитела субъекту, где биспецифическое антитело содержит первый антигенсвязывающий домен, который связывает человеческий CD3, второй антигенсвязывающий домен, который связывает человеческий CD20, и химерный Fc-домен, связанный с каждым из первого и второго антигенсвязывающих доменов, где химерный Fc-домен включает от N-конца к C-концу домен CH1 человеческого IgG1 или человеческого IgG4; шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53 или SEQ ID NO: 54; домен CH2 человеческого IgG4; и домен CH3 человеческого IgG1 или человеческого IgG4,
причем первый антигенсвязывающий домен (А1), который связывает человеческий CD3, содержит три определяющих комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три определяющих комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), причем
(a) A1-HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;
(b) A1-HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;
(c) A1-HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
(d) A1-LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
(e) A1-LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и
(f) A1-LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24,
причем второй антигенсвязывающий домен (А2), который специфически связывает человеческий CD20, содержит три определяющих комплементарность области тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2, HCDR3) и три определяющих комплементарность области легкой цепи (LCDR1, LCDR2, LCDR3), причем
(g) A2-HCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
(h) A2-HCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
(i) A2-HCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
(j) A2-LCDR1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
(k) A2-LCDR2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и
(l) A2-LCDR3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и
где биспецифическое антитело проявляет более высокую аффинность связывания с человеческим FcgRIIA по отношению к человеческому FcgRIIB, и проявляет мало или вообще не проявляет поддающуюся детекции аффинность связывания с человеческим FcgRI и человеческим FcgRIII, как измерено в анализе поверхностного плазмонного резонанса.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что B-клеточный рак выбран из группы, состоящей из фолликулярной лимфомы, B-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, B-клеточной лимфобластной лимфомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, диффузной крупноклеточной B-клеточной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, мантийноклеточной лимфомы, лейкоза ворсистых клеток и лимфомы Беркитта.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что B-клеточный рак представляет собой неходжкинскую лимфому.
25. Способ по п.23, в котором B-клеточный рак представляет собой фолликулярную лимфому.
26. Способ по п.23, в котором B-клеточный рак представляет собой диффузную крупноклеточную B-клеточную лимфому.
27. Способ по п.23, в котором B-клеточный рак представляет собой мантийноклеточную лимфому.
28. Способ по п.23, в котором B-клеточный рак представляет собой лимфому маргинальной зоны.
29. Способ по любому из пп.22-28, отличающийся тем, что субъект поражен опухолью, которая устойчива или не полностью восприимчива к (a) анти-CD20 моноспецифической терапии отдельно или (b) монотерапии ритуксимабом.
30. Способ по любому из пп.22-29, отличающийся тем, что субъект получал терапию анти-CD20 моноспецифическим антителом по меньшей мере от 1 дня до 1 года перед введением биспецифического антитела.
31. Способ по любому из пп.22-30, отличающийся тем, что антитело:
(a) демонстрирует сниженную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) по сравнению с антителом, содержащим Fc-домен дикого типа, согласно данным in vitro анализа цитотоксичности;
(b) демонстрирует незначительную или не демонстрирует выявляемую ADCC;
(c) демонстрирует сниженную комплементзависимую цитотоксичность (CDC) по сравнению с антителом, содержащим Fc-домен дикого типа, согласно данным in vitro анализа цитотоксичности;
(d) демонстрирует менее чем 50%-ную цитотоксичность согласно данным по клеточному лизису, полученным в in vitro анализе;
(e) демонстрирует незначительную или не демонстрирует выявляемую CDC;
(f) индуцирует снижение опосредованного T-клетками уничтожения клеток, несущих Fc-рецепторы, таких как NK-клетки или макрофаги, по сравнению с антителом, содержащим Fc-домен дикого типа; или
(g) индуцирует снижение уничтожения T-клеток, опосредованного клетками, несущими Fc-рецепторы, такими как NK-клетки или макрофаги, по сравнению с антителом, содержащим Fc-домен дикого типа.
32. Способ по любому из пп.22-31, отличающийся тем, что первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывает человеческий CD3, содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), включающую SEQ ID NO: 10, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR), включающую SEQ ID NO: 18.
33. Способ по любому из пп.22-32, отличающийся тем, что второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывает человеческий CD20, содержит аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), включающую SEQ ID NO: 2, и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR), включающую SEQ ID NO: 18.
34. Способ по любому из пп.22-33, отличающийся тем, что биспецифическое антитело содержит Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26.
35. Способ по любому из пп.22-33, отличающийся тем, что биспецифическое антитело содержит Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
36. Способ по любому из пп.22-33, отличающийся тем, что биспецифическое антитело содержит Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
37. Способ по любому из пп.22-33, отличающийся тем, что биспецифическое антитело содержит Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32.
38. Способ по любому из пп.22-33, отличающийся тем, что биспецифическое антитело содержит химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, связанный с первым антигенсвязывающим доменом, и химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, связанный со вторым антигенсвязывающим доменом.
39. Способ по любому из пп.22-33, отличающийся тем, что биспецифическое антитело содержит химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32, связанный с первым антигенсвязывающим доменом, и химерный Fc-домен, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, связанный со вторым антигенсвязывающим доменом.

---