(57) 1. Способ протеолитического процессинга одноцепочечного сконструированного клостридиального нейротоксина в соответствующий двухцепочечный сконструированный клостридиальный нейротоксин, причем способ включает:
a) предоставление одноцепочечного сконструированного клостридиального нейротоксина, в котором эндогенная петля активации заменена экзогенной петлей активации; и
b) приведение одноцепочечного сконструированного клостридиального нейротоксина в контакт с энтерокиназой или фактором Xa;
где одноцепочечный сконструированный клостридиальный нейротоксин имеет петлю активации, содержащую полипептидную последовательность Cys-(Xaa)_a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)_b-Cys (SEQ ID NO: 1), где a=1-10 и b=4-20, и где Xaa представляет собой любую аминокислоту, и Yaa представляет собой любую аминокислоту;
где сконструированный клостридиальный нейротоксин не является ботулиническим нейротоксином типа C1 (BoNT/C1); и
где энтерокиназа или фактор Xa гидролизует пептидную связь петли активации, тем самым получая двухцепочечный сконструированный клостридиальный нейротоксин.
2. Способ получения сконструированного клостридиального нейротоксина, причем способ включает:
a) идентификацию эндогенной петли активации клостридиального нейротоксина, где клостридиальный нейротоксин отличается тем, что:
i) пептидная связь вне эндогенной петли активации клостридиального нейротоксина гидролизуется посредством трипсина или Lys-C; и/или
ii) эндогенная петля активации неэффективно протеолитически процессируется трипсином или Lys-C; и
b) замену эндогенной петли активации экзогенной петлей активаций, тем самым получая сконструированный клостридиальный нейротоксин, где экзогенная петля активации содержит полипептидную последовательность Cys-(Xaa)_a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)_b-Cys (SEQ ID NO: 1), где a=1-10 и b=4-20, и где Xaa представляет собой любую аминокислоту, и Yaa представляет собой любую аминокислоту;
где сконструированный клостридиальный нейротоксин не является ботулиническим нейротоксином типа C1 (BoNT/C1).
3. Способ по п.2, где клостридиальный нейротоксин идентифицирован как являющийся пригодным для применения в способе посредством приведения клостридиального нейротоксина в контакт с трипсином или Lys-C и подтверждения гидролиза пептидной связи вне эндогенной петли активации клостридиального нейротоксина.
4. Способ по п.2 или 3, дополнительно включающий приведение сконструированного клостридиального нейротоксина в контакт с энтерокиназой или фактором Xa, тем самым получая соответствующий двухцепочечный сконструированный клостридиальный нейротоксин.
5. Способ по любому из пп.2-4, где эндогенная петля активации представляет собой одну или несколько, выбранных из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31.
6. Способ по любому из пп.1-5, где:
a) a=2-4;
b) a=3;
c) b=6-10;
d) b=8;
e) (экзогенная) петля активации содержит полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, 80% или 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3;
f) (экзогенная) петля активации содержит полипептидную последовательность, имеющую SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3;
g) (экзогенная) петля активации содержит SEQ ID NO: 2; и/или
h) (экзогенная) петля активации состоит из SEQ ID NO: 2.
7. Способ по любому из пп.1-6, где:
a) клостридиальный нейротоксин лишен функционального H_C-домена клостридиального нейротоксина;
b) клостридиальный нейротоксин представляет собой перенацеленный клостридиальный нейротоксин, содержащий неклостридиальную нацеливающую часть (TM);
c) клостридиальный нейротоксин представляет собой перенацеленный клостридиальный нейротоксин, содержащий нацеливающую часть (TM), где TM содержит защитный антиген (PA) токсина сибирской язвы или его фрагмент; и/или
d) клостридиальный нейротоксин имеет полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с полипептидом, содержащим:
i) SEQ ID NO: 52 или ее фрагмент; и
ii) SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 или SEQ ID NO: 60.
8. Способ по любому из пп.1-7, где:
a) клостридиальный нейротоксин выбран из: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X и TeNT;
b) клостридиальный нейротоксин представляет собой BoNT/X, BoNT/E, химерный BoNT или гибридный BoNT; и/или
c) клостридиальный нейротоксин:
i) кодируется нуклеотидной последовательностью, обладающей по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12; или
ii) содержит полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13.
9. Сконструированный клостридиальный нейротоксин, где эндогенная петля активации клостридиального нейротоксина заменена экзогенной петлей активации с получением тем самым сконструированного клостридиального нейротоксина,
где экзогенная петля активации содержит полипептидную последовательность Cys-(Xaa)_a-Ile-Asp/Glu-Gly-Arg-(Yaa)_b-Cys (SEQ ID NO: 1), где a=1-10 и b=4-20, и где Xaa представляет собой любую аминокислоту, и Yaa представляет собой любую аминокислоту,
где клостридиальный нейротоксин характеризуется тем, что: пептидная связь вне эндогенной петли активации клостридиального нейротоксина гидролизована трипсином или Lys-C; и/или эндогенная петля активации неэффективно протеолитически процессируется трипсином или Lys-C, и
где сконструированный клостридиальный нейротоксин не является ботулиническим нейротоксином типа C1 (BoNT/C1).
10. Сконструированный клостридиальный нейротоксин по п.9, где эндогенная петля активации представляет собой одну или несколько, выбранных из SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 или SEQ ID NO: 31.
11. Сконструированный клостридиальный нейротоксин по п.9 или 10, где:
a) a=2-4;
b) a=3;
c) b=6-10;
d) b=8;
e) (экзогенная) петля активации содержит полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70%, 80% или 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3;
f) (экзогенная) петля активации содержит полипептидную последовательность, имеющую SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3;
g) (экзогенная) петля активации содержит SEQ ID NO: 2; и/или
h) (экзогенная) петля активации состоит из SEQ ID NO: 2.
12. Сконструированный клостридиальный нейротоксин по любому из пп.9-11, где:
a) клостридиальный нейротоксин лишен функционального H_C-домена клостридиального нейротоксина;
b) клостридиальный нейротоксин представляет собой перенацеленный клостридиальный нейротоксин, содержащий неклостридиальную нацеливающую часть (TM);
c) клостридиальный нейротоксин представляет собой перенацеленный клостридиальный нейротоксин, содержащий нацеливающую часть (TM), где TM содержит защитный антиген (PA) токсина сибирской язвы или его фрагмент; и/или
d) клостридиальный нейротоксин имеет полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с полипептидом, содержащим:
i) SEQ ID NO: 52 или ее фрагмент; и
ii) SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 или SEQ ID NO: 60.
13. Сконструированный клостридиальный нейротоксин по любому из пп.9-12, где:
a) клостридиальный нейротоксин выбран из: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X и TeNT;
b) клостридиальный нейротоксин представляет собой BoNT/X, BoNT/E, химерный BoNT или гибридный BoNT; и/или
c) клостридиальный нейротоксин:
i) кодируется нуклеотидной последовательностью, обладающей по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12; или
ii) содержит полипептидную последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13.
14. Сконструированный клостридиальный нейротоксин, содержащий полипептидную последовательность, по меньшей мере на 70%, 80% или 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13, предпочтительно содержащий (более предпочтительно состоящий из) SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13.
15. Способ протеолитического процессинга сконструированного клостридиального нейротоксина по любому из пп.9-14 в соответствующий двухцепочечный сконструированный клостридиальный нейротоксин, причем способ включает приведение сконструированного клостридиального нейротоксина в контакт с энтерокиназой или фактором Xa, тем самым получая двухцепочечный сконструированный клостридиальный нейротоксин.
16. Двухцепочечный сконструированный клостридиальный нейротоксин, получаемый способом по любому из пп.1, 4-8 или 15.
17. Фармацевтическая композиция, содержащая сконструированный клостридиальный нейротоксин по любому из пп.9-14 и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант, пропеллент и/или соль.
18. Фармацевтическая композиция, содержащая двухцепочечный сконструированный клостридиальный нейротоксин по п.16, и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент, адъювант, пропеллент и/или соль.
19. Применение сконструированного клостридиального нейротоксина по любому из пп.9-14 в лечении одного или нескольких из: состояния, ассоциированного с нежелательной иммунной секрецией, страбизмом, блефароспазмом, косоглазием, дистонией (например, спастическая дистония, оромандибулярная дистония, очаговая дистония, поздняя дистония, ларингеальная дистония, дистония конечностей, цервикальная дистония), кривошеей (например, спастическая кривошея), применением в косметологии (косметике), при котором представляют интерес нарушения работоспособности клеток/мышц (посредством подавления или инактивации SNARE), нервно-мышечного нарушения или состояния подвижности глаз (например, сопутствующий страбизм, вертикальный страбизм, паралич латеральной прямой мышцы, нистагм, дистироидная миопатия), блефароспазмом, бруксизмом, болезнью Вильсона, тремором, тиками, сегментным миоклонусом, спазмами, спастичностью вследствие хронического рассеянного склероза, спастичностью, приводящей к нарушению контроля мочевого пузыря, спазмом в спине, ушибом или разрывом мышц, тензионными головными болями, синдромом поднимающей мышцы таза, расщепленным позвоночником, поздней дискинезией, болезнью Паркинсона, заиканием, гемифациальным спазмом, нарушением глазного яблока, церебральным параличом, очаговой спастичностью, спастическим колитом, нейрогенным мочевым пузырем, анизмусом, спастичностью конечностей, анальными трещинами, ахалазией, дисфагией, слезоотделением, гипергидрозом, чрезмерным слюноотделением, чрезмерной желудочно-кишечной секрецией, мышечной болью (например, боль в результаты мышечных спазмов), головной болью (например, тензионная головная боль), межбровными складками, морщинами кожи, злокачественной опухолью, нарушениями матки, урогенитальными нарушениями, урогенитально-неврологическими нарушениями, хроническим нейрогенным воспалением и нарушением гладких мышц.
20. Применение двухцепочечного сконструированного клостридиального нейротоксина по п.16 в лечении одного или нескольких из: состояния, ассоциированного с нежелательной иммунной секрецией, страбизмом, блефароспазмом, косоглазием, дистонией (например, спастическая дистония, оромандибулярная дистония, очаговая дистония, поздняя дистония, ларингеальная дистония, дистония конечностей, цервикальная дистония), кривошеей (например, спастическая кривошея), применением в косметологии (косметике), при котором представляют интерес нарушения работоспособности клеток/мышц (посредством подавления или инактивации SNARE), нервно-мышечного нарушения или состояния подвижности глаз (например, сопутствующий страбизм, вертикальный страбизм, паралич латеральной прямой мышцы, нистагм, дистироидная миопатия), графоспазмом, бруксизмом, болезнью Вильсона, тремором, тиками, сегментным миоклонусом, спазмами, спастичностью вследствие хронического рассеянного склероза, спастичностью, приводящей к нарушению контроля мочевого пузыря, спазмом в спине, ушибом или разрывом мышц, тензионными головными болями, синдромом поднимающей мышцы таза, расщепленным позвоночником, поздней дискинезией, болезнью Паркинсона, заиканием, гемифациальным спазмом, нарушением глазного яблока, церебральным параличом, очаговой спастичностью, спастическим колитом, нейрогенным мочевым пузырем, анизмусом, спастичностью конечностей, анальными трещинами, ахалазией, дисфагией, слезоотделением, гипергидрозом, чрезмерным слюноотделением, чрезмерной желудочно-кишечной секрецией, мышечной болью (например, боль в результаты мышечных спазмов), головной болью (например, тензионная головная боль), межбровными складками, морщинами кожи, злокачественной опухолью, нарушениями матки, урогенитальными нарушениями, урогенитально-неврологическими нарушениями, хроническим нейрогенным воспалением и нарушением гладких мышц.
21. Применение фармацевтической композиции по п.17 в лечении одного или нескольких из: состояния, ассоциированного с нежелательной иммунной секрецией, страбизмом, блефароспазмом, косоглазием, дистонией (например, спастическая дистония, оромандибулярная дистония, очаговая дистония, поздняя дистония, ларингеальная дистония, дистония конечностей, цервикальная дистония), кривошеей (например, спастическая кривошея), применением в косметологии (косметике), при котором представляют интерес нарушения работоспособности клеток/мышц (посредством подавления или инактивации SNARE), нервно-мышечного нарушения или состояния подвижности глаз (например, сопутствующий страбизм, вертикальный страбизм, паралич латеральной прямой мышцы, нистагм, дистироидная миопатия), графоспазмом, бруксизмом, болезнью Вильсона, тремором, тиками, сегментным миоклонусом, спазмами, спастичностью вследствие хронического рассеянного склероза, спастичностью, приводящей к нарушению контроля мочевого пузыря, спазмом в спине, ушибом или разрывом мышц, тензионными головными болями, синдромом поднимающей мышцы таза, расщепленным позвоночником, поздней дискинезией, болезнью Паркинсона, заиканием, гемифациальным спазмом, нарушением глазного яблока, церебральным параличом, очаговой спастичностью, спастическим колитом, нейрогенным мочевым пузырем, анизмусом, спастичностью конечностей, анальными трещинами, ахалазией, дисфагией, слезоотделением, гипергидрозом, чрезмерным слюноотделением, чрезмерной желудочно-кишечной секрецией, мышечной болью (например, боль в результаты мышечных спазмов), головной болью (например, тензионная головная боль), межбровными складками, морщинами кожи, злокачественной опухолью, нарушениями матки, урогенитальными нарушениями, урогенитально-неврологическими нарушениями, хроническим нейрогенным воспалением и нарушением гладких мышц.
22. Применение фармацевтической композиции по п.18 в лечении одного или нескольких из: состояния, ассоциированного с нежелательной иммунной секрецией, страбизмом, блефароспазмом, косоглазием, дистонией (например, спастическая дистония, оромандибулярная дистония, очаговая дистония, поздняя дистония, ларингеальная дистония, дистония конечностей, цервикальная дистония), кривошеей (например, спастическая кривошея), применением в косметологии (косметике), при котором представляют интерес нарушения работоспособности клеток/мышц (посредством подавления или инактивации SNARE), нервно-мышечного нарушения или состояния подвижности глаз (например, сопутствующий страбизм, вертикальный страбизм, паралич латеральной прямой мышцы, нистагм, дистироидная миопатия), графоспазмом, бруксизмом, болезнью Вильсона, тремором, тиками, сегментным миоклонусом, спазмами, спастичностью вследствие хронического рассеянного склероза, спастичностью, приводящей к нарушению контроля мочевого пузыря, враждебностью, спазмом в спине, ушибом или разрывом мышц, тензионными головными болями, синдромом поднимающей мышцы таза, расщепленным позвоночником, поздней дискинезией, болезнью Паркинсона, заиканием, гемифациальным спазмом, нарушением глазного яблока, церебральным параличом, очаговой спастичностью, спастическим колитом, нейрогенным мочевым пузырем, анизмусом, спастичностью конечностей, анальными трещинами, ахалазией, дисфагией, слезоотделением, гипергидрозом, чрезмерным слюноотделением, чрезмерной желудочно-кишечной секрецией, мышечной болью (например, боль в результаты мышечных спазмов), головной болью (например, тензионная головная боль), межбровными складками, морщинами кожи, злокачественной опухолью, нарушениями матки, урогенитальными нарушениями, урогенитально-неврологическими нарушениями, хроническим нейрогенным воспалением и нарушением гладких мышц.
23. Нуклеотидная последовательность, кодирующая сконструированный клостридиальный нейротоксин, содержащая последовательность, обладающую по меньшей мере 70% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 12.

---