(57) 1. Термостабильная фитаза, отличающаяся тем, что в последовательность аминокислот фитазы Escherichia coli (кишечной палочки) дикого либо мутированного типа вводится по меньшей мере одна введенная дисульфидная связь;
где последовательность аминокислот фитазы кишечной палочки дикого типа представлена в SEQ ID NO: 1;
где фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит последовательность аминокислот, более чем на 75% идентичную SEQ ID NO: 2, и фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит мутацию в каждом из положений 46, 62, 73, 75, 146, 159 и 255 по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1,
при этом, введенная дисульфидная связь выбрана из следующих:
(A) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 34 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 174 в SEQ ID NO: 1;
(B) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 56 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 103 в SEQ ID NO: 1;
(C) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 57 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 366 в SEQ ID NO: 1;
(D) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 61 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 366 в SEQ ID NO: 1;
(E) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 82 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 296 в SEQ ID NO: 1;
(F) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 128 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 203 в SEQ ID NO: 1;
(G) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 140 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 262 в SEQ ID NO: 1;
(Н) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 156 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 191 в SEQ ID NO: 1;
(I) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 165 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 245 в SEQ ID NO: 1;
(J) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 191 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 210 в SEQ ID NO: 1;
(K) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 196 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 211 в SEQ ID NO: 1;
(L) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 264 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 312 в SEQ ID NO: 1;
(М) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 315 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 380 в SEQ ID NO: 1;
(N) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 322 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 356 в SEQ ID NO: 1;
(О) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 346 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 393 в SEQ ID NO: 1;
(Р) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 349 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 390 в SEQ ID NO: 1;
при условии, что
пункты (С) и (D) не выполняются одновременно;
пункты (Н) и (J) не выполняются одновременно.
2. Термостабильная фитаза по п.1, отличающаяся тем, что фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит мутации W46E, Q62W, А73Р, K75C/Q, S146E, R159Y и Y255D, и необязательно дополнительно содержит по меньшей мере одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из A25F, G70E, K74N, G76T, Т114Н, N137V, D142R, P173S, N204C, H282N, P283G и Р284Т, по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1.
3. Термостабильная фитаза по п.2, отличающаяся тем, что фитаза кишечной палочки мутированного типа дополнительно содержит по меньшей мере одну из следующих мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1: Q1S, Q1V, Q1N, A25F, Q30K, А36K, W37F, P38Y, T39D, I55V, H60S, H60Q, R65H, D69N, G70E, K74D, K74Р, K74L, K74N, G76T, С77А, Q79L, Q79R, Q79A, Q79G, Q79F, S80P, 185V, A101L, С108A, A109D, А109Е, A109G, A109F, А109Р, THIS, T111D, T111Q, T114H, T116A, T118R, T118S, S120R, P123E, N126Y, P127V, P127L, C133A, N137V, N137E, N137S, N137P, A138V, A138H, A138D, A138P, N139P, N139A, N139H, T141R, T141E, T141G, T141A, D142R, S151P, G157R, G157Q, G157N, G157L, G157A, T161P, P173Y, P173S, N176P, N176K, C178A, K183R, Q184S, D185N, D185L, E186V, E186A, S187P, C188A, S189T, N204C, V211W, G233E, G235Y, T245E, Q253V, R267A, H282N, P283G, P284T, K286F, Q287Y, A288E, A288R, A288V, V291I, T295I, V297T, G311S, E315G, E315S, N317L, W318Y, T327Y, L341Y, L341V, F354Y, K363A, K363L, S367F, N369P, T370P, A380P, A380R, A380T, C382A, E383S, R385S, R385V, R385T, C391A, E402R, E402T, E402D, E402P, E402N, C408A.
4. Термостабильная фитаза по п.3, отличающаяся тем, что фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит любую из следующих комбинаций мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1:
W46E, Q62W, А73Р, K75С, S146E, R159Y, N204C, Y255D;
A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, К75С, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, Y255D;
W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, G76T, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т и
A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т.
5. Термостабильная фитаза по п.4, отличающаяся тем, что фитаза кишечной палочки мутированного типа содержит любую из следующих комбинаций мутаций по сравнению с фитазой кишечной палочки дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1:
W46E, Q62W, А73Р, K75С, S146E, R159Y, N204C, Y255D;
A25F, W46E, Q62W, G70E, А73Р, К75С, Т114Н, N137V, D142R, S146E, R159Y, Y255D и
W46E, Q62W, G70E, А73Р, K74N, K75Q, G76T, S146E, R159Y, P173S, Y255D, H282N, P283G, Р284Т.
6. Термостабильная фитаза по п.3, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот фитазы кишечной палочки мутированного типа представлена в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 79 либо SEQ ID NO: 99.
7. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что дисульфидная связь выбрана, по меньшей мере, из одной из (А), (В), (С), (D), (J), (М) либо (О), при условии, что (С) и (D) не выполняются одновременно.
8. Термостабильная фитаза по п.7, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет не менее чем двум или трем из следующих пунктов: (А), (В), (С), (D), (E), (J), (M) и (О), при условии, что (С) и (D) не выполняются одновременно.
9. Термостабильная фитаза по п.7, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (А), (В), (С), (Е), (J) или (М).
10. Термостабильная фитаза по п.7, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет, по меньшей мере, пункту (D) или пункту (О).
11. Термостабильная фитаза по п.10, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пункту (D).
12. Термостабильная фитаза по п.10, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пункту (О).
13. Термостабильная фитаза по п.7, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (В) и (О); (С) и (О); (D) и (О); (М) и (О); (В), (D) и (О) или (D), (М) и (О).
14. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (В) и (О).
15. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (С) и (О).
16. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (М) и (О).
17. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (В), (D) и (О).
18. Термостабильная фитаза по п.13, отличающаяся тем, что последовательность аминокислот удовлетворяет пунктам (D), (М) и (О).
19. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-18, содержащая по меньшей мере одну введенную дисульфидную связь, отличающаяся тем, что дисульфидная связь выбрана из следующих:
(i) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 31 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 176 в SEQ ID NO: 1;
(ii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 31 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 177 в SEQ ID NO: 1;
(iii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 52 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 99 в SEQ ID NO: 1;
(iv) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 59 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 100 в SEQ ID NO: 1;
(v) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 91 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 46 в SEQ ID NO: 1;
(vi) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 141 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 200 в SEQ ID NO: 1;
(vii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 162 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 248 в SEQ ID NO: 1;
(viii) дисульфидная связь, образованная между аминокислотным остатком, соответствующим положению 205 в SEQ ID NO: 1, и аминокислотным остатком, соответствующим положению 257 в SEQ ID NO: 1;
при условии, что пункты (i) и (ii) не выполняются одновременно.
20. Термостабильная фитаза по п.1, отличающаяся тем, что термостабильная фитаза включает любую из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NOs: 4-40, SEQ ID NOs: 80-88 и SEQ ID NOs: 100-108.
21. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-20, отличающаяся тем, что термостабильная фитаза получена из Pichia либо Aspergillus niger посредством гетерологической экспрессии.
22. Термостабильная фитаза по любому из пп.1-21, отличающаяся тем, что аминокислотные остатки, способные к формированию дисульфидных связей, являются цистеиновыми либо гомоцистеиновыми остатками.
23. Полинуклеотид, отличающийся тем, что он кодирует термостабильную фитазу по любому из пп.1-22.
24. Полинуклеотид по п.23, отличающийся тем, что его кодирующая последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в Pichia либо Aspergillus niger.
25. Полинуклеотид по п.23, отличающийся тем, что он включает в себя любую из следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NOs: 41-77, SEQ ID NOs: 90-98 и SEQ ID NOs: 100-118.
26. Клетка организма-носителя, отличающаяся тем, что она включает в себя полинуклеотид по любому из пп.23-25.
27. Клетка организма-носителя по п.26, отличающаяся тем, что данная клетка организма-носителя является грибковой, бактериальной либо растительной клеткой.
28. Клетка организма-носителя по п.27, отличающаяся тем, что данная клетка является дрожжевой клеткой либо клеткой мицелиальных грибов.
29. Клетка организма-носителя по п.28, отличающаяся тем, что данная клетка является клеткой Pichia либо Aspergillus niger.

---