(57) 1. Полипептидный комплекс, содержащий
первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанный с первой константной областью (С1) Т-клеточного рецептора (TCR), и
второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR,
где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между С1 и С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер,
где первый VH функционально связан с С1 в первом соединительном домене и первый VL функционально связан с С2 во втором соединительном домене,
где С1 содержит сконструированную С-бета и С2 содержит сконструированную С-альфа;
С1 содержит сконструированную С-бета и С2 содержит сконструированную С-пре-альфа; или
С1 содержит сконструированную С-гамма и С2 содержит сконструированную С-дельта; или
С1 содержит сконструированную С-дельта и С2 содержит сконструированную С-гамма; и
где первое антитело имеет первую антигенную специфичность.
2. Полипептидный комплекс по п.1, где ненативная межцепочечная связь образуется между первым мутантным остатком, содержащимся в С1, и вторым мутантным остатком, содержащимся в С2, необязательно где по меньшей мере один из первого и второго мутантных остатков является остатком цистеина.
3. Полипептидный комплекс по п.1 или 2, где по меньшей мере один нативный остаток цистеина отсутствует в С1 и/или С2 и/или где по меньшей мере один нативный участок N-гликозилирования отсутствует в С1 и/или С2.
4. Полипептидный комплекс по любому из пп.1-3, где димер содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ненативных межцепочечных связей, необязательно где по меньшей мере одна из ненативных межцепочечных связей является дисульфидной связью.
5. Полипептидный комплекс по любому из пп.1-4, где сконструированная С-бета не сохраняет петлю FG, охватывающую аминокислотные остатки 101-107 нативной С-бета, и/или петлю DE, охватывающую аминокислотные остатки 66-71 нативной С-бета.
6. Полипептидный комплекс по п.5, где:
(а) сконструированная С-альфа содержит любую из SEQ ID NO: 43-48 и/или сконструированная С-бета содержит любую из SEQ ID NO: 33-41,
(b) сконструированная С-пре-альфа содержит любую из SEQ ID NO: 82-83, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317 или 318 и/или сконструированная С-бета содержит любую из SEQ ID NO: 84, 33-41, 319, 320, 321, 322, 323 или 324, или
(c) сконструированная С-гамма содержит любую из SEQ ID NO: 113, 114, 333, 334 или 335, 336, 337, 338, 339 или 340 и/или сконструированная С-дельта содержит любую из SEQ ID NO: 115, 116, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331 или 332.
7. Полипептидный комплекс по п.5 или 6, где:
(а) С1 содержит сконструированную С-бета и С2 содержит сконструированную С-альфа и где первый соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 49, 50, 129 или 130 и/или второй соединительный домен содержит или представляет собой SEQ ID NO: 51 или 52,
(b) С1 содержит сконструированную С-бета и С2 содержит сконструированную С-пре-альфа и где первый соединительный домен содержит SEQ ID NO: 49, 50, 132 или 133 и/или второй соединительный домен содержит SEQ ID NO: 81 или 131,
(с) С1 содержит сконструированную С-гамма и С2 содержит сконструированную С-дельта и где первый соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 117 или 118 и/или второй соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 119 или 120, или
(d) С1 содержит сконструированную С-дельта и С2 содержит сконструированную С-гамма и где первый соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 123 или 124 и/или второй соединительный домен представляет собой SEQ ID NO: 125 или 126.
8. Конъюгат, содержащий полипептидный комплекс по любому из пп.1-7, конъюгированный с фрагментом, где указанный фрагмент представляет собой детектируемую метку, модифицирующий фармакокинетику фрагмент, фрагмент для очистки, цитотоксический фрагмент, антитело или фрагмент антитела.
9. Способ получения полипептидного комплекса по любому из пп.1-7, включающий:
а) введение в клетку-хозяина
первого полинуклеотида, кодирующего первый полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первую вариабельную область тяжелой цепи (VH) первого антитела, функционально связанную с первой константной областью (C1) TCR, и
второго полинуклеотида, кодирующего второй полипептид, содержащий с N-конца к С-концу первый вариабельный домен легкой цепи (VL) первого антитела, функционально связанный со второй константной областью (С2) TCR,
где С1 и С2 могут образовывать димер, содержащий по меньшей мере одну ненативную межцепочечную связь между С1 и С2, и ненативная межцепочечная связь может стабилизировать димер, и
первое антитело имеет первую антигенную специфичность, и
b) экспрессию полипептидного комплекса в клетке-хозяине;
где указанный способ включает:
c) введение в клетку-хозяина одного или более дополнительных полинуклеотидов, кодирующих второй антигенсвязывающий фрагмент, где второй антигенсвязывающий фрагмент имеет вторую антигенную специфичность, отличающуюся от первой антигенной специфичности, и
d) экспрессию биспецифического полипептидного комплекса клеткой-хозяином;
где указанный способ дополнительно включает выделение полипептидного комплекса или биспецифического полипептидного комплекса.
10. Полипептидный комплекс по любому из пп.5-7, где:
(a) сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 9-35, 52-66, 71-86 и 122-127; и/или
сконструированная С-альфа содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 6-29, 37-67 и 86-95;
(b) сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 9-35, 52-66, 71-86 и 122-127; и/или
сконструированная С-пре-альфа содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 7-19, 26-34, 56-75 и 103-106; или
(c) сконструированная С-дельта содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 8-26, 43-64 и 84-88; и/или
сконструированная С-гамма содержит мутантный остаток цистеина в области контакта, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 11-35 и 55-76.
11. Полипептидный комплекс по любому из пп.5-7, где:
(а) сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S56C, S16C, F13C, V12C, Е14С, F13C, L62C, D58C, S76C и R78C, и/или сконструированная С-альфа содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из Т49С, Y11C, L13C, S16C, V23C, Y44C, Т46С, L51C и S62C, необязательно где сконструированная С-бета и сконструированная С-альфа содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из S56C в С-бета и Т49С в С-альфа, S16C в С-бета и Y11C в С-альфа, F13C в С-бета и L13C в С-альфа, S16C в С-бета и L13C в С-альфа, V12C в С-бета и S16C в С-альфа, Е14С в С-бета и S16C в С-альфа, F13C в С-бета и V23C в С-альфа, L62C в С-бета и Y44C в С-альфа, D58C в С-бета и Т46С в С-альфа, S76C в С-бета и Т46С в С-альфа, S56C в С-бета и L51C в С-альфа, S56C в С-бета и S62C в С-альфа и R78C в С-бета и S62C в С-альфа, и где указанная пара остатков цистеина может образовывать ненативную межцепочечную дисульфидную связь, дополнительно необязательно где отсутствует нативный остаток цистеина в положении С74 сконструированной С-бета;
(b) сконструированная С-бета содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S16C, А18С, Е19С, F13C, А11С, S56C и S76C, и/или сконструированная С-пре-альфа содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S11C, А13С, I16C, S62C, Т65С и Y59, необязательно где сконструированная С-бета и сконструированная С-пре-альфа содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из S16C в С-бета и S11C в С-пре-альфа, А18С в С-бета и S11C в С-пре-альфа, Е19С в С-бета и S11C в С-пре-альфа, F13C в С-бета и А13С в С-пре-альфа, S16C в С-бета и А13С в С-пре-альфа, А11С в С-бета и I16C в С-пре-альфа, S56C в С-бета и S62C в С-пре-альфа, S56C в С-бета и Т65С в С-пре-альфа и S76C в С-бета и Y59C в С-пре-альфа, и где указанная пара мутантных остатков цистеина может образовывать ненативную межцепочечную дисульфидную связь; или
(c) сконструированная С-гамма содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из S17C, Е20С, F14C, Т12С, М62С, Q57C и А19С, и/или сконструированная С-дельта содержит мутантный остаток цистеина, которым заменяют аминокислотный остаток в положении, выбранном из F12C, М14С, N16C, D46C, V50C, F87C и Е88С, необязательно где сконструированная С-гамма и сконструированная С-дельта содержат пару мутантных остатков цистеина, которыми заменяют пару аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Q57C в С-гамма и V50C в С-дельта, А19С в С-гамма и Е88С в С-дельта, S17C в С-гамма и F12C в С-дельта, Е20С в С-гамма и F12C в С-дельта, F14C в С-гамма и М14С в С-дельта, Т12С в С-гамма и N16C в С-дельта, М62С в С-гамма и D46C в С-дельта и А19С в С-гамма и F87C в С-дельта, и где указанная пара мутантных остатков цистеина может образовывать межцепочечную дисульфидную связь.
12. Полипептидный комплекс по любому из пп.5-7, где:
(a) по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует в сконструированной С-бета и/или сконструированной С-альфа, необязательно где нативный участок гликозилирования в сконструированной С-бета представляет собой N69, и/или нативный участок (нативные участки) гликозилирования в сконструированной С-альфа выбран(ы) из N34, N68, N79 и любой их комбинации;
(b) по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует в сконструированной С-бета и/или сконструированной С-пре-альфа, необязательно где отсутствующий участок гликозилирования в сконструированной С-бета представляет собой N69, и/или отсутствующий участок гликозилирования в сконструированной С-пре- альфа представляет собой N50; или
(с) по меньшей мере один нативный участок гликозилирования отсутствует в сконструированной С-гамма и/или сконструированной С-дельта, необязательно где нативный участок гликозилирования в сконструированной С-гамма представляет собой N65, и/или нативный участок (нативные участки) гликозилирования в сконструированной С-дельта представляет (представляют) собой один или оба из N16 и N79.
13. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептидный комплекс по любому из пп.1-7.
14. Выделенной вектор, содержащий выделенный полинуклеотид по п.13.
15. Клетка-хозяин, содержащая выделенный полинуклеотид по п.13 или выделенный вектор по п.14.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептидный комплекс по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.
17. Применение полипептидного комплекса по любому из пп.1-7 для производства лекарственного средства для лечения состояния у нуждающегося в этом индивидуума, где указанное лекарственное средство вводят в терапевтически эффективном количестве.
18. Полипептидный комплекс по любому из пп.1-7, где С1 или С2 содержит сконструированную С-альфа и по меньшей мере один нативный остаток Ser в сконструированной С-альфа подвергают мутации для снижения О-гликозилирования, необязательно где мутантный аминокислотный остаток выбран из S19, S36, S41, S91 и S94.

---