(57) 1. Способ анализа биологического образца организма, чтобы определить классификацию уровня рака, где указанный биологический образец содержит молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), происходящие из нормальных клеток и потенциально из клеток, связанных с раковым заболеванием, причем, по меньшей мере, некоторые из молекул ДНК в биологическом образце являются внеклеточными молекулами ДНК, при этом указанный способ включает
анализ множества молекул ДНК из указанного биологического образца, где анализ молекулы ДНК включает
определение локализации указанной молекулы ДНК в геноме указанного организма;
определение того, метилирована ли указанная молекула ДНК в одном или большем числе сайтов, где указанное определение включает осуществление чувствительного к метилированию массивного-параллельного секвенирования;
для каждого из множества сайтов:
определение соответствующего количества молекул ДНК, которые метилированы в указанном сайте;
вычисление первого уровня метилирования на основе соответствующих количеств молекул ДНК, метилированных во множестве сайтов, при этом первый уровень метилирования может соответствовать индексу метилирования, плотности метилирования или доле метилированных цитозинов, где индекс метилирования относится к доле молекул ДНК, показывающих метилирование в одном и более сайтах относительно количества молекул ДНК, покрывающих один и более сайтов, где плотность метилирования области представляет собой количество молекул ДНК в сайтах указанной области, показывающей метилирование, разделенное на количество молекул ДНК, покрывающих сайты области, и где доля метилированных цитозинов относится к цитозиновым сайтам, в отношении которых показано метилирование из числа проанализированных остатков цитозина в области;
генерирование сравнения первого уровня метилирования с первым предельным значением, где указанное первое предельное значение представляет собой референсный уровень метилирования, находится на указанном расстоянии от референсного уровня метилирования или устанавливается по указанному референсному уровню метилирования, где референсный уровень метилирования определяют по одному или более образцам, уровень рака в которых известен; и
определение первой классификации уровня рака, являющейся классификацией по метилированию, на основе указанного сравнения, где уровень рака может относится либо к наличию рака, стадии рака, размеру раковой опухоли, либо к наличию метастазов, общей опухолевой нагрузке на организм и/или к другой мере тяжести ракового заболевания.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществление чувствительного к метилированию секвенирования включает
обработку молекул ДНК бисульфитом натрия;
осуществление секвенирования обработанных молекул ДНК.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что обработка молекул ДНК бисульфитом натрия представляет собой часть бисульфитной конверсии с использованием Tet или окислительного бисульфитного секвенирования для детекции 5-гидроксиметилцитозина.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что относительные количества молекул ДНК определяют путем выравнивания ридов последовательностей, полученных при чувствительном к метилированию секвенировании.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что определение того, метилирована ли указанная молекула ДНК в одном или большем числе сайтов, включает применение расщепления чувствительными к метилированию рестрикционными ферментами, специфической к метилированию ПЦР, зависимой от метилирования преципитации ДНК, связывающего метилированную ДНК белка/пептида или мономолекулярного секвенирования без обработки бисульфитом натрия.
6. Способ по п.1, также включающий
для каждой из первого множества областей генома
определение соответствующего количества молекул ДНК, происходящих из указанной области, в биологическом образце;
вычисление соответствующего нормированного значения по соответствующему количеству молекул ДНК, происходящих из указанной области;
сравнение соответствующего нормированного значения с референсным значением для определения того, наблюдается ли в области делеция или амплификация, где референсное значение может быть определено из нормального образца, значения другого гаплотипа или значения для другой области;
определение первого количества областей из первого множества областей генома, для которых было определено присутствие делеции или амплификации;
сравнение указанного первого количества с первым пороговым значением для определения второй классификации уровня рака, которая является классификацией по абберациям числа копий; и
использование первой классификации и второй классификации для определения третьей классификации уровня рака, которая является классификаций по метилированию и по абберациям числа копий.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что первое пороговое значение представляет собой процент от первого множества областей, для которых было определено присутствие делеции или амплификации.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что третья классификация положительна по раковому заболеванию только в том случае, если и первая классификация, и вторая классификация указывают на раковое заболевание.
9. Способ по п.1 или 6, отличающийся тем, что если первая классификация указывает на наличие ракового заболевания в организме, то способ включает дополнительно идентификацию типа ракового заболевания, связанного с указанным организмом, путем сравнения первого уровня метилирования с соответствующим значением, определенным для других организмов, при этом по меньшей мере два из указанных других организмов идентифицированы как имеющие различные типы раковых заболеваний.
10. Способ по п.6, отличающийся тем, что если третья классификация указывает на раковое заболевание в организме, то способ включает дополнительно идентификацию типа ракового заболевания, связанного с указанным организмом, путем сравнения первого количества областей с соответствующими значениями, определенными для других организмов.
11. Способ по п.1 или 6, отличающийся тем, что вычисление первого уровня метилирования включает
идентификацию второго множества областей генома;
идентификацию одного или большего количества сайтов в составе каждой области второго множества областей;
вычисление уровня метилирования области для каждой области второго множества областей, при этом первый уровень метилирования соответствует первой области второго множества областей,
где генерирование сравнения первого уровня метилирования с первым предельным значением дополнительно включает
сравнение каждого из уровней метилирования области с соответствующим предельным значением для области, включающее сравнение первого уровня метилирования с первым предельным значением; и
где определение первой классификации уровня рака на основе указанного сравнения включает
определение второго количества областей из второго множества областей, которые, как было определено, имеют уровень метилирования области, превышающий соответствующее предельное значение для области; и
сравнение указанного второго количества областей со вторым пороговым значением для определения первой классификации.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанные области, которые, как было определено, имеют уровень метилирования области, превышающий соответствующее предельное значение для области, соответствуют первому набору областей, и включающий дополнительно
сравнение уровней метилирования области из первого набора областей с соответствующими уровнями метилирования области у других организмов для первого набора областей, при этом у указанных других организмов имеется по меньшей мере два из следующего: раковое заболевание первого типа, отсутствие ракового заболевания и раковое заболевание второго типа; и
определение того, имеется ли у организма раковое заболевание первого типа, отсутствует ли раковое заболевание или имеется ли раковое заболевание второго типа на основании указанного сравнения.
13. Способ по п.12, где сравнение включает
разбиение на кластеры указанных других организмов на основании соответствующих уровней метилирования области из первого набора областей других организмов, причем два из указанных кластеров соответствуют любым двум пунктам из первого типа ракового заболевания, отсутствия ракового заболевания и второго типа ракового заболевания,
определение, к какому кластеру принадлежит организм.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что при разбиении на кластеры указанных других организмов используются уровни метилирования области указанного организма.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанные кластеры включают первый кластер, соответствующий первому типу раковых заболеваний, второй кластер, соответствующий второму типу раковых заболеваний, и третий кластер, соответствующий отсутствию раковых заболеваний.
16. Способ по п.13, отличающийся тем, что разбиение на кластеры указанных других организмов основано дополнительно на соответствующих нормированных значениях второго набора областей для указанных других организмов, где указанный второй набор областей соответствует областям, для которых было определено присутствие делеции или амплификации, и где соответствующее нормированное значение для области определяют по соответствующему количеству молекул ДНК из указанной области; при этом указанный способ дополнительно включает
для каждой из второго набора областей:
определение соответствующего количества молекул ДНК как происходящих из указанной области;
вычисление соответствующего нормированного значения по соответствующему количеству молекул ДНК из указанной области; и
сравнение соответствующих нормированных значений второго набора областей для указанного организма с соответствующими нормированными значениями для других организмов, в рамках определения того, к какому кластеру принадлежит указанный организм.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что разбиение на кластеры указанных других организмов основано дополнительно на соответствующих плотностях метилирования гиперметилированных CpG-островков, и указанный способ дополнительно включает
для каждого из гиперметилированных CpG-островков:
определение соответствующей плотности метилирования, и
сравнение соответствующих плотностей метилирования гиперметилированных CpG-островков у указанного организма с плотностями метилирования у других организмов в рамках определения того, к какому кластеру принадлежит указанный организм.
18. Способ по п.11, также включающий
для каждой из второго множества областей:
вычисление соответствующей разности между уровнем метилирования области и соответствующим предельным значением для области; и
вычисление соответствующей вероятности, которая является вероятностью получения соответствующей разницы случайно согласно статистическому распределению;
при этом определение второго количества областей из второго множества областей включает
вычисление кумулятивного показателя, включающего сумму соответствующих вероятностей.
19. Способ по п.18 отличающийся тем, что вычисление указанного кумулятивного показателя включает
вычисление логарифма соответствующей вероятности каждой области второго множества областей для получения соответствующего логарифмического результата; и
вычисление суммы, включающей соответствующие логарифмические результаты.
20. Способ по п.18, отличающийся тем, что соответствующая разность каждой области второго множества областей нормирована по стандартному отклонению, связанному с соответствующим предельным значением для области.
21. Способ по п.18, отличающийся тем, что второе пороговое значение соответствует максимальному кумулятивному показателю от референсной группы образцов других организмов.
22. Способ по п.11, отличающийся тем, что второе пороговое значение представляет собой процент, и при этом сравнение второго количества областей с вторым пороговым значением включает деление указанного второго количества областей на число второго множества областей перед сравнением с указанным вторым пороговым значением.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанное число второго множества областей соответствует всему второму множеству областей.
24. Способ по п.11, отличающийся тем, что первое множество областей совпадает со вторым множеством областей.
25. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный биологический образец берут до лечения, и дополнительно включающий
повторение способа по п.11 для другого биологического образца, взятого после лечения, для получения:
следующего первого количества областей, для которых было определено присутствие делеции или амплификации; и
следующего второго количества областей, которые, как было определено, имеют уровень метилирования области, превышающий соответствующее предельное значение для области;
сравнение первого количества со следующим первым количеством и второго количества со следующим вторым количеством для определения прогноза для указанного организма.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что сравнение первого количества со следующим первым количеством и второго количества со следующим вторым количеством для определения прогноза для указанного организма включает
определение первой разности между первым количеством и следующим первым количеством;
сравнение указанной первой разности с одним или несколькими порогами для первой разности;
определение второй разности между вторым количеством и следующим вторым количеством; и
сравнение второй разности с одним или несколькими порогами второй разности.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что делают более плохой прогноз, если первая разность ниже одного из порогов первой разности, чем в тех случаях, когда указанная первая разность превышает один из порогов первой разности, и при этом делают более плохой прогноз, если вторая разность ниже одного из порогов второй разности, чем в тех случаях, когда указанная вторая разность превышает один из порогов второй разности.
28. Способ по п.25, отличающийся тем, что указанное лечение представляет собой иммунотерапию, хирургию, радиационную терапию, химиотерапию, терапию на основе антител, эпигенетическую терапию или таргетную терапию.
29. Способ по п.1, отличающийся тем, что первое предельное значение представляет собой указанное расстояние от референсного уровня метилирования, установленного по биологическому образцу, полученному из здорового организма.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанное расстояние представляет собой указанное число стандартных отклонений от референсного уровня метилирования.
31. Способ по п.1, отличающийся тем, что первое предельное значение устанавливают по референсному уровню метилирования, определенному по предыдущему биологическому образцу из указанного организма, полученному раньше, чем исследуемый биологический образец.
32. Способ по п.1, где способу предшествует
определение фракционной концентрации опухолевой ДНК в биологическом образце;
определение того, превышает ли фракционная концентрация опухолевой ДНК в биологическом образце минимальное значение; и
в том случае, если фракционная концентрация не превышает минимальное значение, маркировку указанного биологического образца как непригодного для анализа.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что минимальное значение определяют на основе ожидаемой разности между уровнями метилирования для опухоли и референсного уровня метилирования.
34. Способ по п.1, где вычисление первого уровня метилирования также включает
измерение размера молекул ДНК, расположенных в множестве сайтов; и
нормировку первого уровня метилирования на основе измеренных размеров молекул ДНК перед сравнением первого уровня метилирования с первым предельным значением.
35. Способ по п.34, отличающийся тем, что нормировка первого уровня метилирования на основе измеренных размеров включает
отбор молекул ДНК, имеющих первый размер, где первый размер является предопределенным; и
использование выбранных молекул ДНК для расчета первого уровня метилирования, первое предельное значение соответствует первому размеру.
36. Способ по п.35, отличающийся тем, что первый размер представляет собой диапазон длин.
37. Способ по п.35, отличающийся тем, что молекулы ДНК выбирают на основании физического разделения молекул ДНК по размеру.
38. Способ по п.35, отличающийся тем, что осуществление чувствительного к метилированию массивного параллельного секвенирования дает пару последовательностей для каждой молекулы ДНК, и отбор молекул ДНК первого размера включает
определение размера молекул ДНК путем сравнения пар последовательностей множества молекул ДНК с референсным геномом; и
отбор молекул ДНК, имеющих первый размер.
39. Способ по п.34, отличающийся тем, что нормировка первого уровня метилирования на основе измеренных размеров включает
определение функциональной зависимости между размером и уровнями метилирования, где функциональную зависимость определяют путем измерения уровней метилирования молекул ДНК различных размеров и построения графика измеренных значений; и
использование указанной функциональной зависимости для нормировки первого уровня метилирования,
где указанная функциональная зависимость обеспечивает масштабирующие значения, соответствующие соответствующим размерам.
40. Способ по п.39, где использование функциональной зависимости для нормировки первого уровня метилирования включает
вычисление среднего размера, соответствующего молекулам ДНК, используемым для расчета первого уровня метилирования; и
умножение указанного первого уровня метилирования на соответствующее масштабирующее значение.
41. Способ по п.39, где использование функциональной зависимости для нормировки первого уровня метилирования включает
для каждого из множества сайтов:
для каждой из молекул ДНК, локализованных в указанном сайте:
получение соответствующего размера молекулы ДНК в указанном сайте; и
использование масштабирующего значения, соответствующего указанному соответствующему размеру, для нормировки вклада молекулы ДНК в соответствующее количество молекул ДНК, которые метилированы в указанном сайте.
42. Способ по п.1, отличающийся тем, что множество сайтов включает CpG-сайты, причем указанные CpG-сайты организованы во множество CpG-островков, каждый CpG-островок включает один или большее количество CpG-сайтов, при этом первый уровень метилирования соответствует первому CpG-островку множества CpG-островков.
43. Способ по п.42, где каждый из CpG-островков отбирается как имеющий среднее значение плотности метилирования, которое ниже желаемого процента в референсной группе образцов других организмов, и где каждый из CpG-островков отбирается как имеющий коэффициент вариации для средней плотности метилирования в референсной группе ниже желаемого процента множества CpG-островков.
44. Способ по п.42, также включающий
для каждого из CpG-островков:
определение того, гиперметилирован ли CpG-островок относительно референсной группы образцов от других организмов путем сравнения уровня метилирования CpG-островка с соответствующим предельным значением;
для каждого из гиперметилированных CpG-островков:
определение соответствующей плотности метилирования;
вычисление кумулятивного показателя по соответствующим плотностям метилирования; и
сравнение указанного кумулятивного показателя с кумулятивным предельным значением для определения первой классификации.
45. Способ по п.44, отличающийся тем, что вычисление кумулятивного показателя по соответствующим плотностям метилирования включает
для каждого из гиперметилированных CpG-островков:
вычисление соответствующей разности между соответствующей плотностью метилирования и референсной плотностью; и
вычисление соответствующей вероятности, которая является вероятностью получения соответствующей разницы случайно согласно статистическому распределению; и
применение суммы соответствующих вероятностей для определения кумулятивного показателя.
46. Способ по п.45, отличающийся тем, что кумулятивный показатель определяют путем:
для каждого гиперметилированного CpG-островка гиперметилированных CpG-островков:
вычисления логарифма соответствующей вероятности для получения соответствующего логарифмического результата; и
вычисления суммы, включающей соответствующие логарифмические результаты.
47. Способ по п.45, отличающийся тем, что каждая соответствующая разность нормирована по стандартному отклонению, связанному с референсной плотностью.
48. Способ по п.44, отличающийся тем, что кумулятивное предельное значение соответствует максимальному кумулятивному показателю референсной группы.
49. Способ по п.44, отличающийся тем, что определение того, гиперметилирован ли первый CpG-островок, включает
сравнение первого уровня метилирования с первым предельным значением и со вторым предельным значением,
при этом первое предельное значение соответствует среднему значению плотностей метилирования для референсной группы плюс 2%, а второе предельное значение соответствует трем стандартным отклонениям плюс среднее значение плотностей метилирования для референсной группы.
50. Способ по п.1, также включающий
для каждой из первого множества областей генома:
определение соответствующего количества молекул ДНК как происходящих из указанной области;
вычисление соответствующего нормированного значения по соответствующему количеству; и
сравнение указанного соответствующего нормированного значения с референсным значением для определения того, наблюдается ли в соответствующей области делеция или амплификация;
определение первого набора областей, все из которых, как было определено, демонстрируют что-либо одно из делеции, амплификации или нормальной представленности, при этом первый уровень метилирования соответствует первому набору областей;
определение второго набора областей, все из которых, как определено, демонстрируют что-либо второе из делеции, амплификации или нормальной представленности; и
вычисление второго уровня метилирования на основе соответствующих количеств молекул ДНК, метилированных в сайтах второго набора областей,
при этом сравнение первого уровня метилирования с первым предельным значением включает
вычисление параметра, связывающего первый уровень метилирования и второе метилирование, где параметр включает отношение или разницу между первым уровнем метилирования и вторым уровнем метилирования; и
сравнение указанного параметра с первым предельным значением.
51. Способ по п.50, отличающийся тем, что первый уровень метилирования представляет собой статистический показатель, отражающий уровень метилирования области, рассчитанный для каждой области из первого набора областей, и при этом второй уровень метилирования представляет собой статистический показатель уровней метилирования области, рассчитанный для каждой области второго набора областей.
52. Способ по п.51, отличающийся тем, что указанный статистический показатель определяют с применением t-критерия Стьюдента, дисперсионного анализа (ANOVA) или критерия Краскела-Уоллиса.
53. Способ по п.50, отличающийся тем, что вычисление указанного параметра включает применение распределения вероятностей к отношению или разности для получения вероятности, являющейся параметром.
54. Способ по любому из пп.1, 5-53, в котором указанный биологический образец получают таким способом, чтобы получить молекулы нуклеиновой кислоты, которые свободны от клеток в биологическом образце.
55. Способ по п.54, в котором биологический образец выбирают из группы, состоящей из плазмы и сыворотки крови.
56. Способ по п.54, в котором биологический образец получают центрифугированием.
57. Машиночитаемый носитель, хранящий множество инструкций, которые нужны при выполнении управляющих команд компьютерной системой для реализации способа, описанного здесь, причем указанные инструкции включают стадии по любому из пунктов, представленных выше.
58. Компьютерная система, содержащая один и более процессоров и машиночитаемый носитель, хранящий множество инструкций, которые нужны при выполнении управляющих команд компьютерной системой для реализации способа по любому из пп.1 и 5-56.

---