(57) 1. Выделенное биспецифическое антитело к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR)/рецептору фактора роста гепатоцитов (c-Met), содержащее:
a) первую тяжелую цепь (HC1), содержащую константный домен 3 HC1 (HC1 СН3) и вариабельный участок 1 HC1 (VH1), содержащий определяющие комплементарность участки тяжелой цепи HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 210, 211 и 212 соответственно;
b) вторую тяжелую цепь (HC2), содержащую константный домен 3 HC2 (HC2 СН3) и вариабельный участок 2 НС2 (VH2), содержащий HCDR1, HCDR2 и HCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 216, 217 и 218 соответственно;
c) первую легкую цепь (LC1), содержащую вариабельный участок 1 легкой цепи (VL1), содержащий определяющие комплементарность участки легкой цепи LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 213, 214 и 215 соответственно; и
d) вторую легкую цепь (LC2), содержащую вариабельный участок 2 легкой цепи (VL2), содержащий LCDR1, LCDR2 и LCDR3 с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 219, 220 и 221 соответственно,
где пара VH1 и VL1 образует первый антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с EGFR, пара VH2 и VL2 образует второй антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с c-Met;
где антитело представляет собой IgG₁ и имеет замену F405L в плече связывания EGFR и замену K409R в плече связывания c-Met в константном домене СН3 для усиления гетеродимеризации с образованием биспецифического антитела.
2. Биспецифическое антитело по п.1, где
антитело ингибирует фосфорилирование связанных с внеклеточными сигналами киназ 1 и 2 (ERK1/2) в клеточной линии NCI-H292, NCI-H1975 или SKMES-1 со значением IC₅₀, которое по меньшей мере приблизительно в 10 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 20 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 30 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 40 раз меньше, по меньшей мере приблизительно в 50 раз меньше или по меньшей мере приблизительно в 60 раз меньше по сравнению со значением IC₅₀ для ингибирования фосфорилирования ERK1/2 в клеточных линиях NCI-H292, NCI-H1975 или SKMES-1 смесью контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего тяжелую цепь 3 (НС3) и легкую цепь 3 (LC3), и контрольного одновалентного антитела к с-Met, содержащего тяжелую цепь 4 (НС4) и легкую цепь 4 (LC4);
НС3 и НС1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно;
фосфорилирование ERK1/2 измеряют в цельноклеточных лизатах методом сэндвич-ИФА с применением антитела к фосфо-ERK1/2 в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела, связывающегося с нефосфорилированной и фосфорилированной ERK1/2, в качестве детекторного антитела.
3. Биспецифическое антитело по п.1 или 2, где антитело ингибирует фосфорилирование ERK1/2 со значением IC₅₀ приблизительно 2´10^{-9 М или менее, приблизительно 1}´10^{-9 М или менее или приблизительно 1}´10^{-10 М или менее.}
4. Биспецифическое антитело по п.2 или 3, где ERK1 фосфорилирован на остатках Thr202 и Tyr204, a ERK2 фосфорилирован на остатках Thr185 и Tyr197.
5. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-4, где
антитело ингибирует фосфорилирование протеинкиназы В (AKT) на Ser473 в клеточной линии NCI-H1975 со значением IC₅₀, по меньшей мере приблизительно в 70 раз меньшим по сравнению со значением IC₅₀ для ингибирования фосфорилирования AKT по Ser473 в клеточной линии NCI-H1975 смесью контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего НС3 и LC3, и контрольного одновалентного антитела к c-Met, содержащего НС4 и LC4;
НС3 и НС1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно;
фосфорилирование AKT на Ser473 измеряют в цельноклеточных лизатах методом сэндвич-ИФА с применением антитела, связывающегося с нефосфорилированной и фосфорилированной AKT, в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела к фосфорилированной на Ser473 AKT в качестве детекторного антитела.
6. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-5, где
антитело ингибирует фосфорилирование AKT на Thr308 в клеточной линии NCI-H1975 со значением IC₅₀, по меньшей мере приблизительно в 100 раз меньшим по сравнению со значением IC₅₀ для ингибирования фосфорилирования AKT на Thr308 в клеточной линии NCI-H1975 смесью контрольного одновалентного антитела к EGFR, содержащего НС3 и LC3, и контрольного одновалентного антитела к с-Met, содержащего НС4 и LC4;
НС3 и НС1, LC3 и LC1, HC4 и НС2, а также LC4 и LC2 имеют идентичные аминокислотные последовательности соответственно;
фосфорилирование AKT на Thr308 измеряют в цельноклеточных лизатах методом сэндвич-ИФА с применением антитела, связывающегося с нефосфорилированной и фосфорилированной AKT, в качестве захватывающего антитела и конъюгированного с электрохемилюминесцентным соединением антитела к фосфорилированной на Thr308 AKT в качестве детекторного антитела.
7. Биспецифическое антитело по п.5 или 6, где антитело ингибирует фосфорилирование AKT на Ser473 или Thr308 со значением IC₅₀, равным приблизительно 1´10^{-9 М или менее.}
8. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-7, где биспецифическое антитело связывается с EGFR, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 73, на остатках EGFR K489, I491, K467 и S492 и с с-Met на остатках PEFRDSYPIKYVHAF (SEQ ID NO: 238) и FAQSKPDSAEPMDRSA (SEQ ID NO: 239).
9. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-8, где антитело ингибирует рост клеток NCI-H292 или NCI-H1975 со значением IC₅₀, по меньшей мере приблизительно в 300 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 400 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 500 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 600 раз меньшим, по меньшей мере приблизительно в 700 раз меньшим или по меньшей мере приблизительно в 800 раз меньшим по сравнению со значением IC₅₀ для ингибирования роста клеток NCI-H292 или NCI-H1975 цетуксимабом, если клетки NCI-H292 или NCI-H1975 выращивают в условиях с низким прикреплением.
10. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-9, где антитело ингибирует рост опухоли из экспрессирующих HGF клеток SKMES-1 у мышей SCID Beige с процентным (%) значением Т/С на 36 сутки, по меньшей мере в 500 раз меньшим по сравнению с цетуксимабом при введении биспецифического антитела и цетуксимаба в дозе 20 мг/кг.
11. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-10, где антитело нейтрализует передачу сигналов EGFR и c-Met.
12. Биспецифическое антитело по п.1, где VH1, VL1, VH2 и VL2 содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 189, 190, 193 и 194 соответственно.
13. Биспецифическое антитело по п.12, содержащее 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 консервативных аминокислотных замен в НС1, LC1, HC2 или LC2.
14. Биспецифическое антитело по п.13, содержащее замену M252Y/S254T/T256E в НС1 и/или в НС2, где нумерация остатков соответствует индексу ЕС.
15. Биспецифическое антитело по любому из пп.1-14, где антитело имеет 2-антенарную структуру гликана с содержанием фукозы в диапазоне приблизительно от 1 до приблизительно 15%.
16. Биспецифическое антитело по п.2, где НС1, LC1, HC2 и LC2 кодированы синтетическими полинуклеотидами, содержащими последовательности SEQ ID NO: 205, 206, 207 и 208 соответственно.
17. Выделенный синтетический полинуклеотид, кодирующий НС1, НС2, LC1 или LC2 по п.16.
18. Выделенный полинуклеотид по п.17, содержащий полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 205, 206, 207 или 208.
19. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.17 или 18.
20. Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор по п.19.
21. Способ получения выделенного биспецифического к EGFR/c-Met антитела по п.12, включающий:
a) объединение выделенного моноспецифического двухвалентного антитела к EGFR, содержащего две тяжелые цепи SEQ ID NO: 199 и две легкие цепи SEQ ID NO: 200, и выделенного моноспецифического двухвалентного антитела к с-Met, содержащего две тяжелые цепи SEQ ID NO: 201 и две легкие цепи SEQ ID NO: 202, в смеси с молярным соотношением приблизительно 1:1;
b) введение в смесь восстанавливающего агента;
c) инкубирование смеси в течение от приблизительно 90 мин до приблизительно 6 ч;
d) удаление восстанавливающего агента;
e) очистку биспецифического антитела к EGFR/c-Met антитела, содержащего первую тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 210, 211 и 212, и вторую тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 216, 217 и 218, первую легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 213, 214 и 215, и вторую легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 219, 220 и 221, где пара первой тяжелой цепи и первой легкой цепи образует первый связывающий домен, который специфически связывается с EGFR, и пара второй тяжелой цепи и второй легкой цепи образует второй связывающий домен, который специфически связывается с с-Met.
22. Способ по п.21, где восстанавливающий агент представляет собой 2-меркаптоэтаноламин (2-МЕА).
23. Способ по п.22, где 2-МЕА присутствует в концентрации от приблизительно 25 до приблизительно 75 мМ.
24. Способ по п.23, где стадию инкубации проводят при температуре от приблизительно 25 до приблизительно 37°С.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело по любому из пп.1-16 и фармацевтически приемлемый носитель.
26. Способ лечения онкологического больного, включающий введение терапевтически эффективного количества биспецифического к EGFR/c-Met антитела по пп.2, 12 больному в течение периода времени, достаточного для лечения рака, где рак представляет собой рак эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), легочную аденокарциному, мелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак глотки, рак носа, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак языка, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка, рак тимуса, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак печени, гепатоклеточную карциному (НСС) или спорадическую или наследственную папиллярную почечную карциному (PRCC).
27. Способ по п.26, где рак связан с активирующей EGFR мутацией, амплификацией гена EGFR, повышенным уровнем циркулирующего HGF, активирующей c-Met мутацией, амплификацией гена c-Met или мутацией KRAS.
28. Способ по п.27, где активирующая EGFR мутация представляет собой замену G719A, G719X (X представляет собой любую аминокислоту), L861X (X представляет собой любую аминокислоту), L858R, Е746K, L747S, E749Q, А750Р, A755V, V765M, L858P или Т790М, делецию Е746-А750, делецию R748-P753, вставку Ala (А) между М766 и А767, вставку Ser, Val и Ala (SVA) между S768 и V769 и вставку Asn и Ser (NS) между Р772 и Н773.
29. Способ по п.28, где активирующая EGFR мутация представляет собой замену L858R, del (E476, A750) и/или Т790М.
30. Способ по п.27, где мутация KRAS имеет замену G12V или G12C.
31. Способ по п.30, где мутация KRAS имеет замену G12V.
32. Способ по п.27, где больной резистентен или приобрел резистентность к лечению эрлотинибом, гефитинибом, афатинибом, СО-1686, AZD9192 или цетуксимабом.
33. Способ по п.26, где субъект является гомозиготным по фенилаланину в положении 158 в CD16 или гетерозиготным по валину и фенилаланину в положении 158 в CD16.
34. Способ по п.26, включающий введение второго терапевтического агента.
35. Способ по п.34, где второй терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент или средство для таргетной противораковой терапии.
36. Способ по п.35, где химиотерапевтический агент представляет собой цисплатин или винбластин.
37. Способ по п.35, где химиотерапевтический агент или средство для таргетной противораковой терапии представляет собой ингибитор тирозинкиназы EGFR, с-Met, HER2, HER3, HER4 или VEGFR.
38. Способ по п.37, где ингибитор тирозинкиназы представляет собой эрлотиниб, гефитиниб или афатиниб.
39. Способ по п.34, где второй терапевтический агент вводят одновременно или по отдельности.
40. Способ по п.39, где второй терапевтический агент вводят последовательно.
41. Способ ингибирования роста или пролиферации клеток, экспрессирующих EGFR и/или с-Met, включающий приведение клеток в контакт с биспецифическим антителом по пп.2, 12.
42. Способ ингибирования роста или метастазирования экспрессирующей EGFR и/или c-Met опухоли или раковых клеток у больного, включающий введение больному эффективного количества биспецифического антитела по пп.2, 12.
43. Способ по п.42, где опухоль, эскпрессирующая EGFR и/или c-Met, представляет собой рак эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), легочную аденокарциному, мелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак глотки, рак носа, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак языка, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка, рак тимуса, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак печени, гепатоклеточную карциному (НСС) или спорадическую или наследственную папиллярную почечную карциному (PRCC).
44. Способ по п.43, где экспрессирующая EGFR и/или c-Met опухоль связана с активирующей EGFR мутацией, амплификацией гена EGFR, повышенным уровнем циркулирующего HGF, активирующей c-Met мутацией, амплификацией гена c-Met или мутацией KRAS.
45. Способ по п.44, где активирующая EGFR мутация представляет собой замену G719A, G719X (X представляет собой любую аминокислоту), L861X (X представляет собой любую аминокислоту), L858R, Е746K, L747S, E749Q, А750Р, A755V, V765M, L858P или Т790М, делецию Е746-А750, делецию R748-P753, вставку Ala (А) между М766 и А767, вставку Ser, Val и Ala (SVA) между S768 и V769 и вставку Asn и Ser (NS) между Р772 и Н773.
46. Способ по п.45, где активирующая EGFR мутация представляет собой замену L858R, del (E476, A750) и/или Т790М.
47. Способ по п.44, где мутация KRAS имеет замену G12V или G12C.
48. Способ по п.47, где мутация KRAS имеет замену G12V.
49. Применение биспецифического антитела по любому из пп.1-16 для терапии.
50. Применение биспецифического антитела по любому из пп.1-16 для лечения рака, где рак представляет собой рак эпителиальных клеток, рак молочной железы, рак яичников, рак легких, немелкоклеточный рак легких (NSCLC), легочную аденокарциному, мелкоклеточный рак легких, колоректальный рак, рак анального канала, рак простаты, рак почек, рак мочевого пузыря, рак головы и шеи, рак глотки, рак носа, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак ротовой полости, рак языка, рак пищевода, вагинальный рак, рак шейки матки, рак селезенки, тестикулярный рак, рак желудка, рак тимуса, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак печени, гепатоклеточную карциному (НСС) или спорадическую или наследственную папиллярную почечную карциному (PRCC).

---