(57) 1. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, содержащий по меньшей мере одну цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 6, 53 и 88, где указанные остатки домена FN3 соответствуют аминокислотным положениям в SEQ ID NO: 27.
2. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, содержащий по меньшей мере одну цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 8, 10, 14, 15, 20, 45, 48, 54, 59 и 64, где указанные остатки домена FN3 соответствуют аминокислотным положениям в SEQ ID NO: 27.
3. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина, содержащий по меньшей мере одну цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 11, 16, 30, 34, 38, 40, 41, 47, 60, 62, 70, 83, 84 и 85, где указанные остатки домена FN3 соответствуют аминокислотным положениям в SEQ ID NO: 27.
4. Пептид по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий фрагмент, увеличивающий период полужизни.
5. Пептид по п.4, в котором фрагмент, увеличивающий период полужизни, представляет собой альбумин-связывающую молекулу, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или, по меньшей мере, участок Fc-области иммуноглобулина.
6. Способ получения пептида домена FN3 с внедренными остатками цистеина по любому из пп.1-5, включающий:
(i) мутагенез нуклеотидной последовательности исходного домена FN3 путем замены одного или более нуклеотидных остатков на нуклеотидные остатки, кодирующие остаток аминокислоты цистеина, для кодирования домена FN3 с внедренными остатками цистеина;
(ii) экспрессию домена FN3 с внедренными остатками цистеина и
(iii) извлечение домена FN3 с внедренными остатками цистеина.
7. Способ по п.6, где этап мутагенеза включает выполнение сайт-направленного мутагенеза.
8. Способ по п.7, включающий экспрессию домена FN3 с внедренными остатками цистеина в E.coli.
9. Способ по п.7, дополнительно включающий после этапа извлечения реагирование домена FN3 с внедренными остатками цистеина с химическим реагентом, реагирующим с тиольной группой, с созданием химически конъюгированного домена FN3 с внедренными остатками цистеина.
10. Способ по п.9, дополнительно включающий после этапа реагирования измерение связывания EGFR с химически конъюгированным доменом FN3 с внедренными остатками цистеина.
11. Способ по п.10, дополнительно включающий после этапа реагирования измерение ингибирования роста клеток опухолевой линии со сверхэкспрессией EGFR после добавления химически конъюгированного домена FN3 с внедренными остатками цистеина.
12. Способ по п.10, дополнительно включающий после этапа реагирования измерение связывания c-Met с химически конъюгированным доменом FN3 с внедренными остатками цистеина.
13. Способ по п.10, дополнительно включающий после этапа реагирования измерение ингибирования роста клеток опухолевой линии со сверхэкспрессией c-Met после добавления химически конъюгированного домена FN3 с внедренными остатками цистеина.
14. Способ по п.10, в котором реагент, реагирующий с тиольными группами, содержит малеимидный фрагмент.
15. Способ по п.14, в котором реагент, реагирующий с тиольными группами, содержит малеимидный фрагмент, который выбирают из группы, состоящей из NEM, MMAE и MMAF.
16. Способ по п.15, в котором химически конъюгированный домен FN3 с внедренными остатками цистеина имеет значение IC₅₀ для роста клеток от около 1,7×10^-10 М до около 1,3×10^-9 М при измерении в клетках H1573 со сверхэкспрессией EGFR.
17. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.1, где указанный пептид имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 242, 248 и 250.
18. Выделенная биспецифическая молекула FN3 с внедренными остатками цистеина, содержащая первый домен фибронектина типа III (FN3) и второй домен FN3, где первый домен FN3 представляет собой домен FN3 с внедренными остатками цистеина по любому из пп.1-5, а второй домен FN3 специфически связывается с рецептором фактора роста гепатоцитов (c-Met) и блокирует связывание фактора роста гепатоцитов (HGF) с c-Met.
19. Выделенная биспецифическая молекула FN3 с внедренными остатками цистеина по п.18, в которой второй домен FN3 содержит цистеиновую замену в положении, которое выбирают из группы, состоящей из остатков 6, 8, 10, 11, 14, 15, 16, 20, 30, 34, 38, 40, 41, 45, 47, 48, 53, 54, 59, 60, 62, 64, 70, 88, 89, 90, 91 и 93 второго домена FN3.
20. Выделенная биспецифическая молекула FN3 с внедренными остатками цистеина по п.19, содержащая аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 219-226 и 257-264.
21. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.19, причем молекула химически конъюгирована с реагентом, реагирующим с тиольными группами.
22. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.21, причем реагент, реагирующий с тиольными группами, представляет собой малеимидный фрагмент.
23. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.22, в которой малеимидный фрагмент выбирают из группы, состоящей из NEM, ПЭГ24-малеимида, флуоресцеин-малеимида, MMAE и MMAF.
24. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.23, в которой первый домен FN3 ингибирует индуцированное EGF фосфорилирование EGFR по тирозиновому остатку EGFR в положении 1173 со значением IC₅₀ от около 0,9×10^-9 М до около 2,3×10^-9 М при измерении в клетках NCI-H292 с применением 50 нг/мл человеческого EGF, а второй домен FN3 ингибирует индуцированное HGF фосфорилирование c-Met по тирозиновому остатку c-Met в положении 1349 со значением IC₅₀ от около 4×10^-10 М до около 1,3×10^-9 М при измерении в клетках NCI-H292 с применением 100 нг/мл человеческого HGF.
25. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.24, имеющая значение IC₅₀ для роста клеток, которое выбирают из группы, состоящей из:
(i) от около 5,0×10^-11 М до около 5,8×10^-10 М при измерении в клетках H1573 со сверхэкспрессией EGFR и
(ii) от около 7,8×10^-12 М до около 1,1×10^-9 М при измерении в клетках A731 со сверхэкспрессией EGFR.
26. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.25, дополнительно содержащая фрагмент, увеличивающий период полужизни.
27. Выделенная биспецифическая молекула с внедренными остатками цистеина по п.26, в которой фрагмент, увеличивающий период полужизни, представляет собой альбумин-связывающую молекулу, полиэтиленгликоль (ПЭГ) или, по меньшей мере, участок Fc-области иммуноглобулина.
28. Способ получения выделенной биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина по любому из пп.18-27, включающий:
(i) мутагенез нуклеотидной последовательности исходной биспецифической молекулы путем замены одного или более нуклеотидных остатков на нуклеотидные остатки, кодирующие остаток цистеина, для кодирования биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина;
(ii) экспрессию биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина и
(iii) извлечение биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина.
29. Способ по п.28, в котором этап мутагенеза включает выполнение сайт-направленного мутагенеза.
30. Способ по п.29, включающий экспрессию биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина в E.coli.
31. Способ по п.29, дополнительно включающий после этапа извлечения реагирование биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина с химическим реагентом, реагирующим с тиольными группами, с созданием химически конъюгированной биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина.
32. Способ по п.31, дополнительно включающий этап, который выбирают из группы, состоящей из:
(i) измерения связывания с EGFR химически конъюгированной биспецифической молекулой с внедренными остатками цистеина;
(ii) измерения ингибирования стимулированного EGF фосфорилирования EGFR в клеточной линии химически конъюгированной биспецифической молекулой с внедренными остатками цистеина;
(iii) измерения ингибирования стимулированного HGF фосфорилирования с-Met в клеточной линии химически конъюгированной биспецифической молекулой с внедренными остатками цистеина и
(iv) измерения ингибирования роста клеток опухолевой линии со сверхэкспрессией EGFR после добавления химически конъюгированной биспецифической молекулы с внедренными остатками цистеина.
33. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.1, дополнительно включающий метионин на N-конце пептида.
34. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.33, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 210 и SEQ ID NO: 212.
35. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.2, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244 и SEQ ID NO: 247.
36. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.2, дополнительно включающий метионин на N-конце пептида.
37. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.36, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206 и SEQ ID NO: 209.
38. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.3, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246 и SEQ ID NO: 249.
39. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.3, дополнительно включающий метионин на N-конце пептида.
40. Выделенный пептид домена фибронектина типа III (FN3) с внедренными остатками цистеина по п.39, где указанный пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208 и SEQ ID NO: 211.

---