(57) 1. Способ масштабного промышленного выделения и очистки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), включающий этапы, в которых
i) выделяют тельца включения, содержащие Г-КСФ, из клеток Е. Coli, полученных в результате культивирования с высокой плотностью клеток, включающего лизис клеток E.coli в буфере для лизиса, содержащего трис, ЭДТА и NaCl, при этом выделение телец включения выполняют с использованием приборов, выбранных из группы, включающей ультразвуковой диспергатор лабораторного масштаба, гомогенизатор клеток с высоким давлением, центрифугирование и фильтрацию;
ii) проводят солюбилизацию Г-КСФ путем инкубации выделенных телец включения, полученных на этапе (i), в реакции солюбилизации, содержащей трис, ЭДТА и мочевину, при этом восстанавливающий агент, включающий цистеин, добавляют в реакцию солюбилизации после 1 ч инкубации,
iii) проводят рефолдинг солюбилизированного Г-КСФ, полученного на этапе (ii), путем разведения солюбилизированного G-CSF в буфере для рефолдинга для создания реакции рефолдинга, и инкубирования реакции рефолдинга в течение 12-28 ч при комнатной температуре, при этом буфер для рефолдинга содержит трис, мочевину, сорбитол и окисляющий агент, выбранный из группы, включающей цистин, цистеин, окисленный глутатион (GSSH) и цистамин;
iv) окисляют рефолдированный раствор Г-КСФ, полученный на этапе (iii), путем добавления в реакцию рефолдинга ацетата натрия и окисляющего агента, выбранного из группы, состоящей из уксусной кислоты, соляной кислоты и ортофосфорной кислоты в количестве, достаточном для достижения значения рН в диапазоне от 3,0 до 5,5;
v) осветляют окисленный раствор Г-КСФ, полученный на этапе (iv), при этом осветление осуществляется одним или обеими из фильтрации и центрифугирования; и
vi) очищают Г-КСФ из осветленного раствора Г-КСФ, полученного на этапе (v), с использованием катионообменной хроматографии с последующей хроматографией с гидрофобным взаимодействием (ХГВ), при этом каждая из катионообменной хроматографии и хроматографии с гидрофобным взаимодействием включает неподвижную фазу и подвижную фазу,
причем Г-КСФ представляет собой рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, и
выход продукта по данному способу находится в пределах от 50 до 70%.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий этап (vii), на котором проводят конъюгирование очищенного Г-КСФ, полученного на этапе (vi), с полиэтиленгликолем (ПЭГ) для получения монопегированного Г-КСФ путем инкубирования перемешанной реакционной смеси для конъюгации, содержащей буферный раствор для конъюгации, ПЭГ и от 10 до 30 мМ восстанавливающего агента, в течение 12-18 ч при комнатной температуре;
причём буферный раствор для конъюгации содержит один или более из ацетата натрия, фосфата ацетата, гидрофосфата калия, дигидрофосфата калия, гидрофосфата динатрия, гидрофталата калия и тетрабората натрия и имеет значение рН в диапазоне 5,0-5,8; и
восстанавливающий агент включает один или более из цианоборгидрида натрия, триацетоксиборгидрида натрия, боргидрида натрия, дитионита натрия и гидросульфита натрия.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что буферный раствор для конъюгации содержит ацетат натрия;
восстанавливающий агент представляет собой 20 мМ цианоборгидрид натрия;
реакционную смесь для конъюгации инкубируют в течение 12-16 ч;
ПЭГ представляет собой 20 кДа ПЭГ альдегид, и
реакционная смесь для конъюгации содержит от 3 до 5 раз (мас./мас.) большее количество 20 кДа ПЭГ альдегида, чем Г-КСФ.
4. Способ по п.2, дополнительно включающий этап (viii), в котором
очищают монопегированный Г-КСФ, полученный на этапе (vii), с помощью катионообменной хроматографии;
при этом выход продукта на стадии (viii) по данному способу составляет от 60 до 75%;
катионообменная хроматография включает неподвижную фазу и подвижную фазу;
причем неподвижная фаза катионообменной хроматографии на этапе (viii) представляет собой MacroCap-SP, SP Sepharose FF или Fractogel SO₃;
подвижная фаза на этапе (viii) включает один или более из ацетата натрия, уксусной кислоты и NaCl;
причём способ для элюирования на этапе (viii) представляет собой ступенчатый градиент, линейный градиент или их комбинацию.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что неподвижная фаза катионообменной хроматографии на этапе (viii) представляет собой MacroCap-SP;
подвижная фаза катионообменной хроматографии на этапе (viii) содержит от 10 до 50 мМ ацетата натрия; и
способ для элюирования на этапе (viii) представляет собой линейный градиент.
6. Способ по п.1, дополнительно включающий промывку выделенных телец включения, полученных на этапе (i), в одном или более буферах для промывки в течение 60-90 мин при температуре в диапазоне от 20 до 25°С,
при этом буфер для лизиса содержит 100 мМ трис, 250 мМ ЭДТА и 250 мМ NaCl и имеет значение рН в диапазоне от 7,5 до 8,5;
выделение телец включения осуществляют с помощью комбинации ультразвукового диспергатора лабораторного масштаба и гомогенизатора клеток с высоким давлением;
буфер для промывки содержит один или более из трис-ЭДТА-тритонового буфера, трис-ЭДТА-дезоксихолатного буфера, трис-NaCl-мочевинного буфера, трисового буфера и тритон Х-100;
буфер для промывки содержит один или более из 30-50 мМ трис, 3-7 мМ ЭДТА, 0,1-0,5М мочевины, 1-2М NaCl и 0,8-1,5% тритон Х-100; и
буфер для промывки имеет значение рН в диапазоне от 7,5 до 8,5.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что солюбилизационный буфер содержит 6-8М мочевины, 20-50 мМ трис и 2-7 мМ ЭДТА;
при этом значение рН реакции солюбилизации находится в диапазоне от 9,5 до 10,5;
реакция солюбилизации включает от 20 до 100 мМ цистеина; и
выделенные тельца включения инкубируются в солюбилизационном буфере в течение 2-3 ч.
8. Способ по п.1, дополнительно включающий осветление солюбилизированного Г-КСФ, полученного на этапе (ii), с помощью центрифугирования с ускорением 8000-15000 g.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что рефолдинг солюбилизированного Г-КСФ включает постепенное разбавление солюбилизированного Г-КСФ в 10 объемах буфера для рефолдинга;
при этом окисляющий агент в буфере для рефолдинга представляет собой цистин;
буфер для рефолдинга содержит 50 мМ трис, 0,5М мочевины, 5% сорбитола и 0-5 мМ цистина; и
окисление рефолдированного раствора Г-КСФ включает добавление ацетата натрия до конечной концентрации 20 мМ и добавление соляной кислоты.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что реакцию рефолдинга инкубируют в течение 12-18 ч при комнатной температуре;
при этом буфер для рефолдинга содержит 2 мМ цистина; и
значение рН окисленного рефолдированного раствора Г-КСФ находится в диапазоне от 3,5 до 4,5.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что значение рН окисленного рефолдированного раствора Г-КСФ составляет 4,0.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что осветление окисленного раствора Г-КСФ на этапе (v) включает микрофильтрацию фильтром 0,2 мкм;
при этом неподвижная фаза катионообменной хроматографии на этапе (vi) представляет собой SP-Sepharose FF, CM-Sepharose FF, SP-Sepharose HP, Fractogel SO₃ или Fractogel SE HiCap;
подвижная фаза катионообменной хроматографии на этапе (vi) включает один или более из ацетата натрия, уксусной кислоты, фосфата натрия, ортофосфорной кислоты и хлорида натрия;
неподвижная фаза хроматографии с гидрофобным взаимодействием на этапе (vi) представляет собой Phenyl Sepharose FF, Butyl Sepharose, Nuviac-Prime, HEA HyperCel, PPA HyperCel, Phenyl Sepharose HP, МЕР HyperCel или Capto Adhere; и
подвижная фаза хроматографии с гидрофобным взаимодействием на этапе (vi) включает один или оба из ацетата натрия и уксусной кислоты.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что неподвижная фаза катионообменной хроматографии на этапе (vi) представляет собой CM Sepharose FF;
подвижная фаза катионообменной хроматографии на этапе (vi) включает 40 мМ ацетата натрия; и
неподвижная фаза катионообменной хроматографии на этапе (vi) представляет собой Phenyl Sepharose FF.
14. Способ по п.4, дополнительно включающий концентрирование очищенного монопегированного Г-КСФ с помощью ультрафильтрации для получения композиции, содержащей 9-12 мг/мл монопегированного Г-КСФ.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что размер ультрафильтрационной мембраны имеет предельное значение 10 кДа.
16. Фармацевтическая композиция, включающая


при этом монопегированный Г-КСФ был получен способом по п.1.

---