(57) 1. Способ специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК, включающий следующие этапы:
а) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР), для которой реакционная смесь включает термостабильный фермент, обладающий 5'®3' ДНК полимеразной и 5'®3' экзонуклеазной активностью, а также для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК включает по меньшей мере одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК, и пару зондов, в которой один представляет собой олигонуклеотидный мишень-специфичный зонд, имеющий
3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,
а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на 3'-сегменте мишень-специфичного зонда;
при этом в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
б) проведение плавления реакционной смеси в диапазоне температур, включающем температуру плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, подразумевающее пошаговое изменение температуры реакционной смеси со считыванием флуоресцентного сигнала на каждом шаге, при этом сигнал при плавлении дуплекса генерируется за счет разобщения меток, имеющих перекрывающиеся спектры поглощения и испускания, входящих в состав отщепленного 5'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнального зонда, а нерасщепленный мишень-специфичный зонд образует недетектируемый дуплекс с сигнальным зондом, при плавлении которого сигнал не генерируется, за счет присутствия в его составе двух взаимодействующих меток с перекрывающимися спектрами поглощения и испускания; при этом дифференциация дуплексов, соответствующих идентифицируемым различающимся участкам последовательностей ДНК, осуществляется по двум параметрам - канал детекции и/или температура плавления;
при этом варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК выбирают из следующих двух вариантов:
1) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывается со спектром поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
2. Способ по п.1, в котором осуществляют определение от 1 до 10 идентифицируемых последовательностей ДНК в одном канале амплификатора.
3. Способ по п.1, в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом от 0,01 до 1°С.
4. Способ по п.1, в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют с шагом 0,5°С.
5. Способ по п.1, в котором проведение плавления реакционной смеси осуществляют в диапазоне температур от 0 до 100°С.
6. Способ по п.8, в котором температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК ниже температуры плавления праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК.
7. Способ по п.1, в котором в качестве флуорофора или репортерного флуорофора используют по меньшей мере один из красителей карбоксифлуоресцеин (FAM), 6-карбоксиродамин (R6G), карбокси-X-родамин (ROX), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (6-JOE), тиадикарбоцианин (Су5Ô).
8. Способ по п.1, в котором в качестве гасителя флуоресценции используют гаситель флуоресценции серии BHQ и/или RTQ.
9. Способ по п.1, в котором в качестве термостабильного фермента, обладающего 5'®3' ДНК полимеразной и 5'®3' экзонуклеазной активностью, используют Taq ДНК полимеразу.
10. Способ по п.1, в котором сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.
11. Способ по любому из пп.1-10, в котором осуществляют идентификацию по меньшей мере двух различающихся последовательностей ДНК, при этом реакционная смесь включает по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда,
3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 3'-сегментов мишень-специфичных зондов;
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК.
12. Способ по любому из пп.1-10, в котором осуществляют идентификацию по меньшей мере двух различающихся последовательностей ДНК, при этом реакционная смесь включает по меньшей мере
два различающихся мишень-специфичных зонда,
3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 3'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
13. Способ специфической идентификации по меньшей мере одного полиморфизма в последовательности ДНК способом по любому из пп.1-10, в котором 3'-сегмент мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда состоит из
аллель-детектирующего 5'-фрагмента (S), несущего метку, участок гибридизации которого содержит анализируемый полиморфный сайт и последовательность которого комплементарна одному аллельному варианту, подлежащему специфической идентификации и
3'-фрагмента (D), последовательность которого комплементарна участку ДНК, прилегающему к сайту, содержащему идентифицируемый полиморфизм,
соединенных линкером, состоящим по меньшей мере из 1-10 нуклеозидмонофосфатов, обеспечивающих раздельную гибридизацию двух фрагментов, при этом по длине 3'-сегмент совпадает с участком гибридизации указанной последовательности ДНК, выбранным для идентификации в нем полиморфизма,
при этом мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд в случае полной комплементарности его 3'-сегмента и указанной последовательности ДНК, в том числе в части 5'-фрагмента (S), соответствующего искомому аллельному варианту полиморфизма, расщепляется указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, что в дальнейшем обеспечивает генерацию сигнала на этапе плавления;
напротив, в случае неполной комплементарности 3'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда в части 5'-фрагмента (S) и указанной последовательности ДНК мишень-специфичный зонд расщепляется указанным ферментом по линкеру L с высвобождением 5'-сегмента, связанного с 5'-фрагментом (S), без разобщения меток, входящих в состав мишень-специфичного зонда, что в дальнейшем на этапе плавления не приводит к генерации сигнала, при этом варианты сочетания меток выбирают из следующих двух вариантов:
1) 5'-фрагмент (S) 3'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 5'-фрагмент (S) 3'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
14. Способ по п.13, в котором осуществляют идентификацию по меньшей мере двух полиморфизмов в последовательности ДНК, по одному аллелю для каждого полиморфизма, при этом реакционная смесь включает по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) 3'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из аллелей, подлежащих специфической идентификации, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых различаются по температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 5'-фрагментов (S) 3'-сегментов мишень-специфичных зондов,
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют разную температуру плавления, по которой осуществляют дифференциацию различающихся идентифицируемых полиморфизмов в последовательности ДНК.
15. Способ по п.13, в котором осуществляют идентификацию по меньшей мере двух полиморфизмов в последовательности ДНК, по одному аллелю для каждого полиморфизма, при этом реакционная смесь включает по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда,
5'-фрагменты (S) 3'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из аллелей, подлежащих специфической идентификации и содержат при этом разные флуорофоры, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда,
два сигнальных зонда, содержащих флуорофоры, идентичные или близкие по спектрам поглощения и испускания флуорофорам 5'-фрагментов (S) 3'-сегментов соответствующих комплементарных им мишень-специфичных зондов;
при этом дуплексы, образуемые сигнальными зондами и соответствующими комплементарными им 5'-сегментами мишень-специфичных зондов, имеют одинаковую температуру плавления, а дифференциацию различающихся идентифицируемых полиморфизмов в последовательности ДНК осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
16. Способ по п.13, в котором осуществляют идентификацию по меньшей мере двух аллельных вариантов одного полиморфизма в последовательности ДНК, при этом реакционная смесь включает по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда, 5'-фрагменты (S) 3'-сегментов каждого из которых комплементарны одному из идентифицируемых аллельных вариантов и содержат при этом одинаковые флуорофоры, а 3'-фрагменты (D) идентичны по последовательности, и 5'-сегменты различаются температуре плавления, но содержат при этом одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, при этом дифференциацию аллельных вариантов осуществляют за счет их детекции в различных каналах амплификатора.
17. Способ по п.13, в котором осуществляют идентификацию по меньшей мере двух аллельных вариантов одного полиморфизма в последовательности ДНК, при этом реакционная смесь включает по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда, 5'-фрагменты (S) 3'-сегменты каждого из которых комплементарны одному из идентифицируемых аллельных вариантов и содержат при этом разные флуорофоры, а 3'-фрагменты (D) идентичны по последовательности, и 5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда, при этом по температурам плавления дуплексов осуществляют дифференциацию аллельных вариантов в одном канале амплификатора.
18. Способ по любому из пп.13-17, в котором линкер L в составе мишень-специфичного зонда состоит из 4-10 инозинмонофосфатов.
19. Пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР, состоящая из олигонуклеотидного мишень-специфичного зонда, имеющего
3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом в процессе ПЦР, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку, и
олигонуклеотидного сигнального зонда, комплементарного 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащего метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на 3'-сегменте мишень-специфичного зонда;
выполненных таким образом, что
в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК расщепляется термостабильным ферментом, обладающим 5'®3' ДНК полимеразной и 5'®3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизуется с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
при этом варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК выбирают из следующих двух вариантов:
1) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
20. Пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР по п.19, характеризующаяся тем, что температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, по меньшей мере для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК ниже температуры плавления праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК.
21. Пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР по п.19, характеризующаяся тем, что сигнальный зонд иммобилизован на твердую фазу.
22. Пара зондов для специфической идентификации последовательностей ДНК в процессе ПЦР по любому из пп.19-21, где идентификацию осуществляют в отношении одного или более полиморфизмов в последовательности ДНК, характеризующаяся тем, что
3'-сегмент мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда состоит из
аллель-детектирующего 5'-фрагмента (S), несущего метку, участок гибридизации которого содержит анализируемый полиморфный сайт и последовательность которого комплементарна одному аллельному варианту, подлежащему специфической идентификации и
3'-фрагмента (D), последовательность которого комплементарна участку ДНК, прилегающему к сайту, содержащему идентифицируемый полиморфизм,
соединенных линкером, состоящим по меньшей мере из 1-10 нуклеозидмонофосфатов, обеспечивающих раздельную гибридизацию двух фрагментов, при этом по длине 3'-сегмент совпадает с участком гибридизации на идентифицируемой указанной последовательности ДНК, выбранным для идентификации в нем полиморфизма,
при этом мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд в случае полной комплементарности его 3'-сегмента и указанной последовательности ДНК, в том числе в части 5'-фрагмента (S), соответствующего искомому аллельному варианту полиморфизма, расщепляется ферментом, обладающим 5'®3' ДНК полимеразной и 5'®3' экзонуклеазной активностью, с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, что в дальнейшем обеспечивает генерацию сигнала на этапе плавления;
напротив, в случае неполной комплементарности 3'-сегмента мишень-специфичного олигонуклеотидного зонда в части 5'-фрагмента (S) и указанной последовательности ДНК, мишень-специфичный зонд расщепляется ферментом, обладающим 5'®3' ДНК полимеразной и 5'®3' экзонуклеазной активностью, по линкеру L с высвобождением 5'-сегмента, связанного с 5'-фрагментом (S), без разобщения меток, входящих в состав мишень-специфичного зонда, что в дальнейшем на этапе плавления не приводит к генерации сигнала,
при этом варианты сочетания меток выбирают из следующих двух вариантов:
1) 5'-фрагмент (S) 3'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения соответственно этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 5'-фрагмент (S) 3'-сегмента мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
23. Набор для специфической идентификации по меньшей мере одной последовательности ДНК в образце способом по п.1, включающий, по меньшей мере,
термостабильный фермент, обладающий 5'®3' ДНК полимеразной и 5'®3' экзонуклеазной активностью,
а также для выявления каждой из идентифицируемых последовательностей ДНК по меньшей мере
одну пару праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК, и пару зондов, в которой
один представляет собой мишень-специфичный олигонуклеотидный зонд, имеющий 3'-сегмент, комплементарный идентифицируемому участку последовательности ДНК и содержащий метку, и
5'-сегмент, некомплементарный идентифицируемой последовательности ДНК, последовательность которого выбирается так, чтобы дуплекс, который он образует с сигнальным зондом, имел заданную температуру плавления, и содержащий метку,
а другой - олигонуклеотидный сигнальный зонд, комплементарный 5'-сегменту мишень-специфичного зонда и содержащий метку, идентичную или близкую по спектрам поглощения и испускания метке, содержащейся на 3'-сегменте мишень-специфичного зонда;
при этом зонды выполнены таким образом, что в процессе прохождения ПЦР мишень-специфичный зонд при гибридизации с идентифицируемой последовательностью ДНК способен расщепляться указанным ферментом с высвобождением 5'-сегмента и разобщением входящих в состав мишень-специфичного зонда меток, а 5'-сегмент, в свою очередь, гибридизующеготся с сигнальным зондом, образуя с ним дуплекс;
при этом варианты сочетания меток мишень-специфичного и сигнального зондов для каждой из идентифицируемых различающихся последовательностей ДНК выбирают из следующих двух вариантов:
1) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд в качестве метки несут в своем составе гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - флуорофор, для которого спектр испускания перекрывает спектр поглощения, этого гасителя флуоресценции или репортерного флуорофора,
2) 3'-сегмент мишень-специфичного зонда и сигнальный зонд несут в своем составе флуорофор, а 5'-сегмент мишень-специфичного зонда - гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, для которых спектр поглощения перекрывает спектр испускания этого флуорофора.
24. Набор по п.23, характеризующийся тем, что при плавлении реакционной смеси, получаемой в результате смешивания компонентов набора, в диапазоне температур, включающем температуру плавления дуплекса входящих в набор мишень-специфичного и сигнального зондов, без предварительного проведения ПЦР, указанные дуплексы не детектируются.
25. Набор по п.23, в котором флуорофор или репортерный флуорофор выбран из карбоксифлуоресцеина (FAM), 6-карбоксиродамина (R6G), карбокси-X-родамина (ROX), тетраметилкарбоксиродамина (TAMRA), 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеина (6-JOE).
26. Набор по п.23, в котором гаситель флуоресценции выбран из BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3.
27. Набор по п.23, в котором термостабильный фермент, обладающий 5'®3' ДНК полимеразной и 5'®3' экзонуклеазной активностью, представляет собой Taq ДНК полимеразу.
28. Набор по п.23, в котором по меньшей мере для одной из идентифицируемых последовательностей ДНК зонды выполнены таким образом, что температура плавления дуплекса, образуемого 5'-сегментом мишень-специфичного зонда и сигнальным зондом, ниже температуры плавления праймеров, специфичных для этой последовательности ДНК.
29. Набор по любому из пп.23-28, включающий по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда,
3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК, но содержат одинаковые флуорофоры, и
5'-сегменты которых содержат одинаковые гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания вышеуказанного флуорофора, но различаются по температуре плавления так, чтобы обеспечить возможность осуществить дифференциацию различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по температуре плавления.
30. Набор по любому из пп.23-28, включающий по меньшей мере два различающихся мишень-специфичных зонда,
3'-сегменты каждого из которых комплементарны одной из идентифицируемых последовательностей ДНК и содержат при этом разные флуорофоры так, чтобы обеспечить возможность дифференциации различающихся идентифицируемых последовательностей ДНК по спектрам испускания флуорофоров, и
5'-сегменты которых уникальны по последовательности, то есть способны образовать дуплексы только с соответствующими комплементарными им сигнальными зондами, но одинаковы по температуре плавления и содержат при этом разные гаситель флуоресценции или репортерный флуорофор, спектр поглощения которых перекрывает спектр испускания флуорофора 3'-сегмента этого же мишень-специфичного зонда.

---