(57) 1. Способ получения культуральной жидкости клеток млекопитающего, содержащей высокомолекулярный рекомбинантный фактор фон Виллебранда (rVWF), отличающийся тем, что указанный способ включает этапы:
a) обеспечения основной среды для культивирования клеток;
b) добавления в указанную основную среду соли меди до конечной концентрации меди от 2,4 до 20 мкг/л;
c) обеспечения клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую rVWF;
d) непрерывного культивирования указанных клеток в среде, полученной на этапе b), в результате чего происходит экспрессия и секретирование rVWF указанными клетками в культуральную жидкость, причем концентрацию NH₄⁺ в указанной культуральной жидкости поддерживают на уровне ниже 4 мМ, а плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,5´10⁶ клеток/мл на протяжении всего этапа культивирования; и
e) выделения по меньшей мере части указанной культуральной жидкости клеток, причем указанная выделенная культуральная жидкость клеток имеет удельную ристоцетин-кофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий добавление растительного гидролизата в основную среду на этапе а).
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный гидролизат представляет собой соевый гидролизат.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанная основная среда представляет собой не содержащую животных белков культуральную среду.
5. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанная основная среда представляет собой не содержащую белков культуральную среду.
6. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что указанная основная среда представляет собой культуральную среду с заданным химическим составом.
7. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что конечная концентрация меди в основной среде составляет по меньшей мере 4 мкг/л.
8. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что конечная концентрация меди в основной среде составляет от 2,4 до 6 мкг/л меди.
9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что клетки млекопитающего представляют собой клетки CHO.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что непрерывное культивирование клеток осуществляют в хемостатическом режиме или в режиме перфузии.
11. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что клетки культивируют по меньшей мере в 100 л среды, полученной на этапе b).
12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 2,0´10⁶ клеток/мл на протяжении всего этапа культивирования.
13. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что плотность клеток поддерживают на уровне менее чем 1,5´10⁶ клеток/мл на протяжении всего этапа культивирования.
14. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что отделенная культуральная жидкость имеет удельную ристоцетин-кофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 40 мЕ/мкг rVWF.
15. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что отделенная культуральная жидкость имеет удельную ристоцетин-кофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 50 мЕ/мкг rVWF.
16. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что отделенная культуральная жидкость имеет удельную ристоцетин-кофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 60 мЕ/мкг rVWF.
17. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что отделенная культуральная жидкость имеет удельную ристоцетин-кофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 70 мЕ/мкг rVWF.
18. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что отделенная культуральная жидкость имеет удельную ристоцетин-кофакторную активность rVWF, составляющую по меньшей мере 80 мЕ/мкг rVWF.
19. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что культуральная жидкость содержит по меньшей мере 30% высокомолекулярных мультимеров VWF, состоящих более чем из 10 димеров, или содержит высокомолекулярные мультимеры VWF, состоящие из 14-22 димеров.
20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что rVWF соэкспрессируется с рекомбинантным фактором VIII (rFVIII).
21. Способ по п.20, дополнительно включающий этап очистки rVWF по меньшей мере от 50% rFVIII, присутствующего в отделенной культуральной жидкости.
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что отношение rVWF к rFVIII после очистки составляет по меньшей мере 10:1.
23. Способ по любому из пп.1-22, где указанная соль меди выбрана из сульфата меди, ацетата меди, карбоната меди, хлорида меди, гидроксида меди, нитрата меди и оксида меди.
24. Способ по п.23, где указанная соль меди представляет собой CuSO₄×5H₂O.
25. Культуральная жидкость клеток млекопитающего, содержащая rVWF и обладающая удельной ристоцетин-кофакторной активностью rVWF, составляющей по меньшей мере 30 мЕ/мкг rVWF, которая получена способом по любому из предыдущих пунктов.
26. Культуральная жидкость по п.25, отличающаяся тем, что содержит рекомбинантный фактор VIII (rFVIII).
27. Культуральная жидкость по п.26 в форме для фармацевтического введения.

---