(57) 1. Композиция для стимуляции иммунного ответа против вируса гриппа, содержащая
водный носитель и
эффективное количество липосом, содержащих
димиристоилфосфатидилхолин (DMPC),
димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) или
димиристоилтриметиламмонийпропан (DMTAP) либо и DMPG, и DMTAP,
по меньшей мере один стерин, и
антигенный полипептид, содержащий первую полипептидную последовательность, содержащую по меньшей мере 10 последовательных остатков внеклеточного домена M2 гриппа A, последовательность которого была модифицирована так, чтобы удалить один или более остатков цистеина естественным образом встречающихся в указанном внеклеточном домене M2, а также
вторую полипептидную последовательность, содержащую трансмембранную последовательность природного гетерологического мембранного белка либо происходящую от него, причем в указанной второй полипептидной последовательности имеется количество остатков, достаточное для пересечения липидного бислоя, по меньшей мере девять последовательных остатков из которых по прогнозу образуют a-спираль с показателем гидрофобности приблизительно 0,63 или выше, где показатель гидрофобности рассчитан по методике Эйзенберга,
причем вторая полипептидная последовательность содержит (а) трансмембранную последовательность, закодированную белком, выбранным из группы, состоящей из цитохрома b5, муцина-4 b-цепи, рецептора трансферрина, TNFRSF13B, аминопептидазы N, дипептидилпептидазы 4, фактор синтаксина некроза опухолей 3, BclXL и R9AP, или (b) по меньшей мере 10 последовательных остатков из одной из SEQ ID NOS: 17-25,
причем указанная первая полипептидная последовательность прямо или опосредованно связана с N- или C- концом указанной второй полипептидной последовательности с получением водорастворимого слитого белка, и при этом антигенная полипептидная последовательность слитого белка представлена на внешней поверхности липосом.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что вторая полипептидная последовательность содержит трансмембранную последовательность, закодированную белком цитохрома b5.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что относительные процентные содержания DMPC, DMPG/DMTAP и стерина составляют от 50 до 98% DMPC:от 1 до 25% DMPG/DMTAP:от 1 до 25% стерина, или от 70 до 98% DMPC:от 1 до 15% DMPG/DMTAP:от 1 до 15% стерина, или от 70 до 85% DMPC:от 5 до 15% DMPG/DMTAP:от 10 до 15% стерина, или тем, что относительные процентные доли DMPC, DMPG/DMTAP и стерина составляют приблизительно 75% DMPC, приблизительно 10% DMPG/DMTAP и приблизительно 15% стерина.
4. Композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что липосомы содержат DMPG, при этом липосомы могут не содержать DMTAP.
5. Композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что указанная композиция дополнительно содержит один или более дополнительных компонентов, выбранных из группы, состоящей из пептидогликана, липопептида, липополисахарида, монофосфориллипида A, липотейхоевой кислоты, резиквимода, имиквимода, флагеллина, олигонуклеотидов, содержащих неметилированные CpG-мотивы, a-галактозилцерамида, мурамилдипептида, полностью транс-ретиноевой кислоты, двухцепочечной вирусной РНК, белков теплового шока, диоктадецилдиметиламмония бромида, катионных поверхностно-активных веществ, агонистов toll-подобного рецептора, димиристоилтриметиламмонийпропана и агонистов nod-подобного рецептора, и/или тем, что композиция содержит стерин, который выбран из группы, состоящей из холестерина, холестерилхлороформиата, стигмастерина, ситостерина, эргостерина, ланостерина, десмостерина и кампестерина.
6. Композиция по одному из пп.1-5, отличающаяся тем, что первая полипептидная последовательность содержит по меньшей мере 10 последовательных остатков из остатков 2-22 одной из SEQ ID NOS: 1-9, или по меньшей мере 10 последовательных остатков из одной из SEQ ID NOS: 10-12, или по меньшей мере 10 последовательных остатков из одной из SEQ ID NOS: 13-15, или первая полипептидная последовательность содержит SEQ ID NO: 16.
7. Композиция по одному из пп.1-6, отличающаяся тем, что один или более остатков цистеина удалены из последовательности внеклеточного домена M2 гриппа A посредством мутации интересующего(их) остатка(ов) цистеина в другой остаток, либо обрезанием последовательности внеклеточного домена до интересующего(их) остатка(ов) цистеина.
8. Композиция по одному из пп.1-7, отличающаяся тем, что вторая полипептидная последовательность содержит трансмембранную последовательность, закодированную одной из SEQ ID NOS: 26-42.
9. Композиция по одному из пп.1-5, отличающаяся тем, что первая полипептидная последовательность содержит T-клеточную антигенную последовательность, а вторая полипептидная последовательность содержит трансмембранную последовательность, при этом указанная первая полипептидная последовательность содержит одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NOS: 60-81.
10. Применение композиции по одному из пп.1-9 для иммунизации животного, причем указанное применение включает введение композиции парентеральным путем указанному животному.
11. Способ приготовления липосомной композиции по п.1, включающий
рекомбинантное экспрессирование или синтез химическими способами антигенного полипептида, при этом указанный антигенный полипептид находится в мономерной форме в неденатурирующих условиях;
очистку антигенного полипептида в водном растворе;
добавление водного раствора, содержащего антигенный полипептид, к липидной смеси, содержащей (i) DMPC, (ii) DMPG, DMTAP либо и DMPG, и DMTAP и (iii) по меньшей мере один стерин;
высушивание антигенного полипептида и липидной смеси и
обработку ультразвуком высушенного антигенного полипептида и липидной смеси в присутствии водного носителя с получением липосом.
12. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый белок, последовательность которого содержит
последовательность первой нуклеиновой кислоты, кодирующую тиоредоксин;
последовательность второй нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептидную последовательность, содержащую по меньшей мере 10 последовательных остатков внеклеточного домена M2 гриппа A, последовательность которого была модифицирована так, чтобы удалить один или более остатков цистеина естественным образом встречающихся в указанном внеклеточном домене M2; и
последовательность третьей нуклеиновой кислоты, кодирующую трансмембранную последовательность природного гетерологичного мембранного белка либо происходящую от него, причем в указанной второй полипептидной последовательности имеется количество остатков, достаточное для пересечения липидного бислоя, по меньшей мере девять последовательных остатков из которых по прогнозу образуют a-спираль с показателем гидрофобности приблизительно 0,63 или выше, где показатель гидрофобности рассчитан по методике Эйзенберга, причем эта вторая полипептидная последовательность содержит (a) трансмембранную последовательность, закодированную белком, выбранным из группы, состоящей из цитохрома b5, муцина-4 b-цепи, рецептора трансферрина, TNFRSF13B, аминопептидазы N, дипептидилпептидазы 4, фактор синтаксина некроза опухолей 3, BclXL и R9AP, или (b) по меньшей мере 10 последовательных остатков из одной из SEQ ID NOS: 17-25,
при этом указанная последовательность нуклеиновой кислоты имеет такую конфигурацию, что при экспрессии нуклеиновой кислоты тиоредоксин экспрессируется N-терминально к трансмембранной последовательности.
13. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты по п.1, отличающаяся тем, что вторая полипептидная последовательность содержит трансмембранную последовательность, закодированную белком цитохрома b5.
14. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты по п.12, дополнительно содержащая последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок, и/или одну или более дополнительных последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих маркер аффинности, и/или одну или более дополнительных последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих сайт протеазного расщепления.
15. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты по одному из пп.12-14, отличающаяся тем, что
(a) по меньшей мере часть выделенной последовательности нуклеиновой кислоты кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине,
при этом необязательно по меньшей мере часть последовательности выделенной нуклеиновой кислоты кодон-оптимизирована для экспрессии в E. coli, и/или
(b) вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует антигенную последовательность, полипептид-нацеленный лиганд или фузогенную полипептидную последовательность, и/или
(c) третья последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансмембранную последовательность, закодированную белком, выбранным из группы, состоящей из цитохрома b5, муцина-4 b-цепи, рецептора трансферрина, TNFRSF13B, аминопептидазы N, дипептидилпептидазы 4, фактор синтаксина некроза опухолей 3, BclXL и R9AP,
при этом третья последовательность нуклеиновой кислоты необязательно содержит трансмембранную последовательность, закодированную белком цитохрома b5, или одной из SEQ ID NOS: 26-42; и/или
(d) третья последовательность нуклеиновой кислоты необязательно содержит по меньшей мере 10 последовательных остатков из одной из SEQ ID NOS: 17-25.
16. Клетка-хозяин для продуцирования антигенного белка, трансформированная выделенной последовательностью нуклеиновой кислоты по одному из пп.12-15.
17. Применение клетки-хозяина по п.16 для получения антигенного белка, включающее
экспрессию слитого белка, закодированного выделенной последовательностью нуклеиновой кислоты из клетки-хозяина и необязательно
очистку всего или части экспрессируемого слитого белка в водном растворе,
при этом указанное получение необязательно дополнительно включает
добавление водного раствора, содержащего очищенный белок, к липидной смеси, содержащей (i) DMPC, (ii) DMPG, DMTAP либо и DMPG, и DMTAP и (iii) по меньшей мере один стерин;
высушивание очищенного белка и липидной смеси и
обработку ультразвуком высушенного очищенного белка и липидной смеси в присутствии водного носителя с получением липосом.

---