(57) 1. Способ получения библиотеки клонов эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую разнообразный репертуар связывающих молекул, которые распознают мишень, включающий этапы, в которых
обеспечивают молекулы донорной ДНК, кодирующие связывающие молекулы, и эукариотические клетки, при этом указанные связывающие молекулы представляют собой антитела, белки или пептиды,
вводят донорную ДНК в клетки и обеспечивают присутствие в клетке сайт-специфической нуклеазы, причем указанная нуклеаза расщепляет распознаваемую последовательность в клеточной ДНК с образованием сайта встраивания, в котором указанная донорная ДНК встраивается в клеточную ДНК, при этом встраивание осуществляется посредством эндогенных клеточных механизмов репарации ДНК, в результате чего создаются рекомбинантные клетки, содержащие донорную ДНК, встроенную в клеточную ДНК, и
культивируют рекомбинантные клетки для получения клонов,
таким образом обеспечивают библиотеку клонов эукариотических клеток, содержащих донорную ДНК, кодирующую указанный репертуар связывающих молекул.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные связывающие молекулы представляют собой молекулы антител, рецепторы T-клеток и/или мультимерные молекулы, содержащие по меньшей мере первую и вторую субъединицу.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанные связывающие молекулы представляют собой молекулы антител, которые представляют собой полноразмерные иммуноглобулины, IgG, Fab, scFv-Fc или scFv.
4. Способ получения библиотеки клонов эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую разнообразный репертуар мультимерных связывающих молекул, которые распознают мишень, при этом каждая связывающая молекула содержит первую и вторую субъединицу, при этом указанные связывающие молекулы представляют собой антитела, белки или пептиды, причем указанный способ включает этапы, в которых
обеспечивают эукариотические клетки, содержащие ДНК, кодирующую первую субъединицу, и обеспечивают молекулы донорной ДНК, кодирующие вторую субъединицу связывающей молекулы,
вводят указанную донорную ДНК в клетки и обеспечивают присутствие в клетке сайт-специфической нуклеазы, причем указанная нуклеаза расщепляет распознаваемую последовательность в клеточной ДНК с образованием сайта встраивания, в котором указанная донорная ДНК встраивается в клеточную ДНК, при этом встраивание осуществляется посредством эндогенных клеточных механизмов репарации ДНК, в результате чего создаются рекомбинантные клетки, которые содержат донорную ДНК, встроенную в клеточную ДНК, и
культивируют рекомбинантные клетки для получения клонов, содержащих ДНК, кодирующую первую и вторую субъединицы мультимерной связывающей молекулы,
таким образом обеспечивают библиотеку клонов эукариотических клеток, содержащих донорную ДНК, кодирующую указанный репертуар мультимерных связывающих молекул.
5. Способ получения библиотеки клонов эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую разнообразный репертуар мультимерных связывающих молекул, которые распознают мишень, в котором каждая связывающая молекула содержит по меньшей мере первую и вторую субъединицу, при этом указанные связывающие молекулы представляют собой антитела, белки или пептиды, причем указанный способ включает этапы, в которых
обеспечивают молекулы первой донорной ДНК, кодирующие первую субъединицу, и обеспечивают эукариотические клетки,
вводят указанную первую донорную ДНК в клетки и обеспечивают присутствие в клетке сайт-специфической нуклеазы, причем указанная нуклеаза расщепляет распознаваемую последовательность в клеточной ДНК с образованием сайта встраивания, в котором указанная донорная ДНК встраивается в клеточную ДНК, при этом встраивание осуществляется посредством эндогенных клеточных механизмов репарации ДНК, в результате чего создается первый набор рекомбинантных клеток, содержащих первую донорную ДНК, встроенную в клеточную ДНК,
культивируют первый набор рекомбинантных клеток для получения первого набора клонов, содержащих ДНК, кодирующую первую субъединицу,
вводят молекулы второй донорной ДНК, кодирующие вторую субъединицу, в клетки первого набора клонов, причем указанная вторая донорная ДНК встраивается в клеточную ДНК первого набора клонов, в результате чего создают второй набор рекомбинантных клеток, содержащих первую и вторую донорную ДНК, встроенную в клеточную ДНК, и
культивируют второй набор рекомбинантных клеток для получения второго набора клонов, причем эти клоны содержат ДНК, кодирующую первую и вторую субъединицы мультимерной связывающей молекулы,
таким образом обеспечивают библиотеку клонов эукариотических клеток, содержащих донорную ДНК, кодирующую указанный репертуар мультимерных связывающих молекул.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что встраивание молекул указанной второй донорной ДНК осуществляется по способу, включающему обеспечение присутствия в клетке сайт-специфической нуклеазы, причем указанная нуклеаза расщепляет распознаваемую последовательность в клеточной ДНК с образованием сайта встраивания, в котором указанная донорная ДНК встраивается в клеточную ДНК, при этом встраивание осуществляется посредством эндогенных клеточных механизмов репарации ДНК.
7. Способ по любому из пп.3-6, отличающийся тем, что мультимерные связывающие молекулы представляют собой молекулы антител, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) в виде отдельных субъединиц.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанные мультимерные связывающие молекулы представляют собой полноразмерные иммуноглобулины.
9. Способ по п.7 или 8, отличающийся тем, что молекула антитела дополнительно содержит одну или более дополнительных субъединиц, которые могут быть введены в ту же самую донорную ДНК, что и первая или вторая субъединица, или которые могут быть встроены в независимые сайты клеточной ДНК.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что клетки представляют собой клетки высших эукариот с размером генома более чем 2´10⁷ пар оснований.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой клетки млекопитающих.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанные клетки представляют собой клетки HEK293, клетки яичников китайского хомячка (CHO), клетки T-клеточной линии дифференцировки или клетки B-клеточной линии дифференцировки или любые из клеток, которые перечислены в "Энциклопедии линий раковых клеток" или в "Каталоге COSMIC соматических мутаций при раке".
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что распознаваемая последовательность находится в геномной ДНК клеток или распознаваемая последовательность находится в эписомальной ДНК внутри клеток.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что последовательность, распознаваемая сайт-специфической нуклеазой, встречается в клеточной ДНК только один или два раза.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная сайт-специфическая нуклеаза разрезает клеточную ДНК с образованием двунитевого разрыва, который служит сайтом интеграции.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная сайт-специфическая нуклеаза представляет собой мегануклеазу, нуклеазу "цинковые пальцы" (ZFN), нуклеазу TALE, или тем, что расщепление ДНК осуществляется системой CRISPR/Cas.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что донорная ДНК содержит генетический элемент для отбора клеток, в которые произошло встраивание донорной ДНК.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что встраивание донорной ДНК в клеточную ДНК приводит к тому, что экспрессия связывающей молекулы и/или экспрессия генетического селективного элемента происходит под контролем промотора, присутствующего в клеточной ДНК.
19. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что библиотека содержит по меньшей мере 100, 10³, 10⁴, 10⁵ или 10⁶ клонов, причем каждый клон образуется из отдельной рекомбинантной клетки, полученной в результате встраивания донорной ДНК.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что библиотека содержит клоны, кодирующие по меньшей мере 100, 10³, 10⁴, 10⁵ или 10⁶ различных связывающих молекул.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что каждый клон содержит встроенную донорную ДНК, кодирующую только одну или две молекулы из указанного репертуара связывающих молекул, или каждый клон содержит встроенную донорную ДНК, кодирующую одну молекулу из указанного репертуара связывающих молекул.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что эукариотические клетки являются диплоидными и содержат распознаваемую сайт-специфической нуклеазой последовательность, содержащуюся в дупликатных фиксированных локусах клеточной ДНК.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что каждая молекула донорной ДНК кодирует одну связывающую молекулу или субъединицу связывающей молекулы.
24. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что связывающие молекулы представлены на клеточной поверхности.
25. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что связывающие молекулы секретируются из клеток.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что донорная ДНК получена с помощью раундов отбора с помощью фагового дисплея.
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий
культивирование библиотеки клонов для экспрессии связывающих молекул,
выделение одного или более клонов, экспрессирующих представляющую интерес связывающую молекулу, и
создание вторичной библиотеки из одного или более выделенных клонов, причем вторичная библиотека содержит ДНК, кодирующую второй репертуар связывающих молекул, при этом необязательно создание вторичной библиотеки включает выделение донорной ДНК из одного или более выделенных клонов, введение мутации в ДНК для получения вторичной популяции молекул донорной ДНК, кодирующих второй репертуар связывающих молекул, и введение вторичной популяции молекул донорной ДНК в клетки с образованием вторичной библиотеки клеток, содержащих ДНК, кодирующую второй репертуар связывающих молекул, или создание вторичной библиотеки включает введение мутации в указанную донорную ДНК одного или более выделенных клонов путем индукции мутации ДНК в этих клонах.
28. Способ получения разнообразного репертуара связывающих молекул, включающий получение библиотеки с помощью способа по любому из пп.1-27 и культивирование клеток указанной библиотеки для экспрессии связывающих молекул.
29. Способ скрининга связывающих молекул, которые распознают мишень, включающий
получение библиотеки с помощью способа по любому из пп.1-27,
культивирование клеток библиотеки для экспрессии связывающих молекул,
экспонирование мишеней для воздействия связывающих молекул, обеспечивающего распознавание мишени одной или более когнатными связывающими молекулами, в случае наличия, и
обнаружение факта распознавания мишени когнатной связывающей молекулой и, необязательно, выделение клеток клона, содержащего ДНК, кодирующую когнатную связывающую молекулу.
30. Способ скрининга клеток требуемого фенотипа, в котором фенотип обусловлен экспрессией клеткой связывающей молекулы, при этом способ включает
получение библиотеки с помощью способа по любому из пп.1-27,
культивирование библиотеки клонов для экспрессии связывающих молекул и определение того, проявляется ли требуемый фенотип, при этом необязательно указанный способ дополнительно включает
выделение клеток клона, который экспрессирует связывающую молекулу, которая обеспечивает получение требуемого фенотипа, и/или
выделение ДНК, кодирующей связывающую молекулу, из отобранного клона, в результате чего получая ДНК, кодирующую связывающую молекулу, которая обеспечивает получение требуемого фенотипа.
31. Способ по п.29 или 30, отличающийся тем, что связывающие молекулы представляют собой молекулы антител, а мишень представляет собой антиген, или связывающие молекулы представляют собой TCR (рецепторы T-клеток), а мишень представляет собой комплекс ГКГС (главный комплекс гистосовместимости):пептид.
32. Способ по п.31, дополнительно включающий выделение ДНК, кодирующей связывающую молекулу, из отобранного клона с получением в результате ДНК, которая кодирует связывающую молекулу, которая распознает указанную мишень.
33. Способ по п.30 или 32, включающий введение мутации или превращение ДНК в модифицированную ДНК, кодирующую реструктурированную связывающую молекулу.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что связывающая молекула представляет собой scFv, а указанный способ включает превращение ДНК, кодирующей scFv, в ДНК, кодирующую Ig или его фрагмент, с сохранением попарного объединения исходных вариабельных доменов VH и VL.
35. Способ по любому из пп.29, 30 и 32-34, дополнительно включающий введение ДНК в клетку-хозяина, и в некоторых случаях, дополнительно включающий культивирование клеток и концентрирование клеток для получения клеточного осадка или концентрированной клеточной суспензии.
36. Способ по пп.29, 30 или 35, дополнительно включающий культивирование клеток для экспрессии связывающей молекулы и очистку связывающей молекулы.
37. Применение сайт-специфической нуклеазы для адресного расщепления клеточной ДНК при составлении библиотеки эукариотических клеток, содержащих ДНК, кодирующую репертуар связывающих молекул с применением способа по любому из пп.1-36, в котором опосредованное нуклеазой расщепление ДНК улучшает сайт-специфическое встраивание генов связывающих молекул посредством эндогенных клеточных механизмов репарации ДНК.
38. Применение библиотеки, полученной способом по любому из пп.1-27, в качестве дисплейной библиотеки для отбора молекул, связывающихся с требуемой мишенью, или для скрининга клеток, характеризующихся требуемым клеточным фенотипом, где фенотип обусловлен экспрессией клеткой связывающей молекулы.

---