(11)	032438 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	201490534
(22)	2012.09.07
(51)	C40B 50/16 (2006.01) C40B 50/14 (2006.01)
(31)	61/531,820; 61/536,929
(32)	2011.09.07; 2011.09.20
(33)	US
(43)	2014.06.30
(86)	PCT/US2012/054228
(87)	WO 2013/036810 2013.03.14
(71)	(73) ИКС-ЧЕМ, ИНК. (US)
(72)	Кеефе Энтони Д., Вагнер Ричард В., Литовчик Александр, Кларк Мэтью, Куоццо Джон В. (US)
(74)	Лыу Т.Н. (RU)
(54)	СПОСОБЫ МЕЧЕНИЯ ДНК-КОДИРОВАННЫХ БИБЛИОТЕК

(57) 1. Способ введения метки в библиотеку, содержащую кодированную олигонуклеотидом малую молекулу или пептид, который включает:

(i) предоставление олигонуклеотидного "головного" фрагмента, имеющего первую функциональную группу и вторую функциональную группу, причем указанный олигонуклеотидный "головной" фрагмент включает 2'-замещенный нуклеотид, который включает указанную вторую функциональную группу на 3'-конце;

(ii) связывание указанной первой функциональной группы указанного олигонуклеотидного "головного" фрагмента с первым структурным элементом указанной малой молекулы или пептида, причем указанный олигонуклеотидный "головной" фрагмент непосредственно связывается с указанным первым структурным элементом или указанный олигонуклеотидный "головной" фрагмент опосредованно связывается с указанным первым структурным элементом с помощью бифункционального линкера; и

(iii) сшивание указанной второй функциональной группы указанного "головного" фрагмента с олигонуклеотидной меткой первого структурного элемента с образованием кодированной олигонуклеотидом малой молекулы или пептида, причем указанная метка первого структурного элемента содержит по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеотид на 5'-конце и/или на 3'-конце и посредством указанного сшивания образуется ковалентная связь между 2'-замещенным нуклеотидом на 3'-конце олигонуклеотидного "головного" фрагмента и нуклеотидом на 5'-конце метки первого структурного элемента, и где сшивание включает ферментативное сшивание,

где указанные стадии (ii) и (iii) можно осуществлять в любом порядке и указанная олигонуклеотидная метка первого структурного элемента кодирует идентичность первого структурного элемента на указанной стадии (ii), посредством чего создается меченая олигонуклеотидом библиотека.

2. Способ по п.1, в котором указанная олигонуклеотидная метка первого структурного элемента содержит по меньшей мере один 2'-замещенный нуклеотид, такой как 2'-O-метилнуклеотид или 2'-фторнуклеотид.

3. Способ по п.1 или 2, в котором указанный 2'-замещенный нуклеотид представляет собой 2'-O-метилгуанин, 2'-O-метилурацил, 2'-O-метиладенозин, 2'-O-метилтимидин, 2'-O-метилинозин, 2'-O-метилцитидин, 2'-O-метилдиаминопурин, 2'-фторгуанин, 2'-фторурацил, 2'-фтораденозин, 2'-фтортимидин, 2'-фторинозин, 2'-фторцитидин и 2'-фтордиаминопурин.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором стадия (ii) включает связывание указанного олигонуклеотидного "головного" фрагмента непосредственно с указанным первым структурным элементом.

5. Способ по любому из пп.1-3, в котором стадия (ii) включает опосредованное связывание указанного олигонуклеотидного "головного" фрагмента с указанным первым структурным элементом с помощью бифункционального линкера.

6. Способ по любому из пп.1-5, который дополнительно включает:

(iv) связывание олигонуклеотидной метки второго структурного элемента с 3'-концом указанной кодированной олигонуклеотидом малой молекулы или пептида и

(v) связывание второго структурного элемента указанной химической библиотеки с указанным первым структурным элементом,

причем указанные стадии (iv) и (v) можно осуществлять в любом порядке.

7. Способ по п.6, в котором указанная метка второго структурного элемента содержит 2'-замещенный нуклеотид на одном или более из 5'-или 3'-концов или внутри указанной олигонуклеотидной метки второго структурного элемента.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором указанная стадия (iii) и/или стадия (iv), если таковая имеется, включает РНК лигазу и/или ДНК лигазу для связывания указанной олигонуклеотидной метки второго структурного элемента с указанным кодированным олигонуклеотидом химическим соединением и/или включает полиэтиленгликоль и/или один или более растворимых поливалентных катионов.

9. Способ по любому из пп.1-8, который дополнительно включает отделение указанного кодированного олигонуклеотидом химического соединения от любой непрореагировавшей олигонуклеотидной метки или от непрореагировавшего олигонуклеотидного "головного" фрагмента перед любой из стадий связывания (ii)-(v) и/или очистку указанного кодированного олигонуклеотидом химического соединения перед любой из стадий связывания (ii)-(v).

10. Способ по любому из пп.1-9, который дополнительно включает связывание олигонуклеотидных меток одного или более дополнительных структурных элементов с указанным кодированным олигонуклеотидом химическим соединением и связывание одного или более дополнительных структурных элементов с указанным кодированным олигонуклеотидом химическим соединением.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором указанный олигонуклеотидный "головной" фрагмент содержит шпилечную структуру.

12. Способ по любому из пп.1-11, в котором указанный олигонуклеотидный "головной" фрагмент, указанная олигонуклеотидная метка первого структурного элемента, указанная олигонуклеотидная метка второго структурного элемента и/или указанные олигонуклеотидные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, дополнительно содержат первую последовательность, идентифицирующую библиотеку, служебную последовательность и/или последовательность ориджина (репликации).

13. Способ по любому из пп.1-12, который дополнительно включает связывание первой олигонуклеотидной метки, идентифицирующей библиотеку, служебной последовательности, последовательности ориджина (репликации) и/или хвостового фрагмента с указанным комплексом.

14. Способ по любому из пп.1-13, который включает совокупность олигонуклеотидных "головных" фрагментов.