(11)	032406 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	201591252
(22)	2013.12.30
(51)	C12N 15/82 (2006.01) A01N 63/02 (2006.01) A01H 3/04 (2006.01) A01H 5/10 (2006.01)
(31)	61/748,095; 61/748,094; 61/748,101; 61/748,099; 61/814,888; 61/814,890; 61/814,892; 61/814,899; 61/908,855; 61/908,965
(32)	2013.01.01; 2013.01.01; 2013.01.01; 2013.01.01; 2013.04.23; 2013.04.23; 2013.04.23; 2013.04.23; 2013.11.26; 2013.11.26
(33)	US
(43)	2016.02.29
(86)	PCT/IL2013/051085
(87)	WO 2014/106838 2014.07.10
(71)	(73) Эй.Би. СИДЗ ЛТД. (IL)
(72)	Авниэль Амир, Лидор-Нили Эфрат, Маор Руди, Меир Офир, Нойвирт-Брик Орли (IL)
(74)	Ловцов С.В., Левчук Д.В. (RU)
(54)	СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ дсРНК В СЕМЕНА РАСТЕНИЙ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

(57) 1. Способ получения растения, имеющего повышенную устойчивость к насекомым-вредителям, включающий:

а) обработку семян растений раствором, содержащим нетранскрибируемую дсРНК в концентрации от 0,005 до 1,5 мкг/мкл, где нетранскрибируемая дсРНК включает по меньшей мере одну цепочку полинуклеотидов, включающую по меньшей мере один сегмент из 21 или более смежных нуклеотидов гена-мишени насекомого-вредителя в антисмысловой или смысловой ориентации, где указанный ген насекомого-вредителя является геном, существенным для жизнеспособности насекомого-вредителя, где экзогенная молекула дсРНК не интегрирована в геном семени и где семя лишено гетерологичного промотора для стимуляции экспрессии дсРНК; и

b) проращивание семени для получения растения, проявляющего устойчивость к насекомым-вредителям.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ген-мишень насекомого-вредителя выбирают из группы, состоящей из АТФазы, NADPH-(цитохром P450)-оксидоредуктазы, ингибитора апоптозных белков, хитинсинтазы, фактора элонгации трансляции 1α и β-актина.

3. Способ по любому из пп.1 или 2, отличающийся тем, что растение устойчиво к инвазии Spodoptera littoralis, Diabrotica virgifera virgifera или Leptinotarsa decemlineata.

4. Способ по любому из пп.1, 2 или 3, дополнительно включающий стимуляцию (прайминг) семени перед обработкой указанного семени раствором, содержащим нетранскрибируемую дсРНК.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что прайминг осуществляют путем:

(i) промывки семени и

(ii) сушки семени после этапа (i).

6. Семя, включающее молекулу экзогенной нетранскрибируемой дсРНК, включающей последовательность, которая идентична или комплементарна по меньшей мере 21 смежному нуклеотиду гена-мишени насекомого-вредителя или последовательности РНК, транскрибированной из гена-мишени насекомого-вредителя, причем указанный ген-мишень насекомого-вредителя представляет собой ген, существенный для жизнеспособности насекомого-вредителя, причем нетранскрибируемая дсРНК введена в семя в концентрации от 0,005 до 1,5 мкг/мкл, при этом семя лишено гетерологичного промотора для стимуляции экспрессии молекулы дсРНК, а молекула экзогенной дсРНК не интегрирована в геном семени.

7. Семя по п.6, отличающееся тем, что молекула экзогенной дсРНК содержится в эндосперме и/или в зародыше семени.

8. Семя по любому из пп.6 или 7, отличающееся тем, что молекула экзогенной дсРНК содержится в более высокой концентрации в эндосперме семени, чем в зародыше.

9. Семя по любому из пп.6 или 7, отличающееся тем, что ген-мишень насекомого-вредителя выбран из группы, состоящей из АТФазы, NADPH-(цитохром Р450)-оксидоредуктазы, ингибитора апоптозных белков, хитинсинтазы, фактора элонгации трансляции 1α и β-актина.

10. Семя по любому из пп.6 или 7, отличающееся тем, что насекомым-вредителем является Spodoptera littoralis, Diabrotica virgifera virgifera или Leptinotarsa decemlineata.

11. Семя по любому одному из пп.6 или 7, отличающееся тем, что семя затем обработано агентом, выбираемым из группы, состоящей из пестицида, фунгицида, инсектицида и удобрения.

12. Растение, проявляющее устойчивость к насекомым после прорастания из семени, полученное способом по п.1.

13. Растение по п.12, отличающееся тем, что выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сои, риса, пшеницы, томата, огурца, салата, хлопка и рапса.

14. Растение по любому из пп.12, 13, отличающееся тем, что ген-мишень насекомого-вредителя выбран из группы, состоящей из АТФазы, NADPH-(цитохром Р450)-оксидоредуктазы, ингибитора апоптозных белков, хитинсинтазы, фактора элонгации трансляции 1α и β-актина.