(11)	027238 (13) B1	Разделы: A B C E F G H
(21)	201400169
(22)	2012.08.23
(51)	A61K 38/42 (2006.01) A61K 35/14 (2006.01) A61K 35/12 (2006.01) A61K 9/08 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01)
(31)	61/529,279; 13/225,797; 13/275,366
(32)	2011.08.31; 2011.09.06; 2011.10.18
(33)	US
(43)	2014.06.30
(86)	PCT/US2012/051959
(87)	WO 2013/032828 2013.03.07
(71)	(73) БИЛЛИОН КИНГ ИНТЕРНЭШНЛ ЛИМИТЕД (CN)
(72)	Вон Бин Лоу (US), Квок Суй И, Бутт Квок Чу (CN)
(74)	Вахнин А.М. (RU)
(54)	СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ТЕРМОСТОЙКИЙ ПЕРЕНОСЧИК КИСЛОРОДА НА ОСНОВЕ ГЕМОГЛОБИНА

(57) 1. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β перекрестную сшивку более чем 40%, содержащий стадии:

a) предоставление цельной крови млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;

b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающего;

c) фильтрация эритроцитов, которые были отделены от плазмы, для получения фракции отфильтрованных эритроцитов;

d) промывка фракции отфильтрованных эритроцитов для удаления белковых примесей из плазмы, образующихся в промываемых эритроцитах;

e) разрушение промытых эритроцитов для получения раствора, включающего в себя лизат разрушенных эритроцитов;

f) осуществление фильтрации в лизате разрушенных эритроцитов для удаления по меньшей мере части концентрата отходов из лизата для получения первого гемоглобинового раствора;

g) выполнение по меньшей мере одного процесса очистки для удаления одного или нескольких вирусов, концентрата отходов или белковых примесей для получения второго гемоглобинового раствора;

h) перекрестная сшивка второго гемоглобинового раствора бис-3,5-дибромсалицилфумаратом для получения перекрестно-сшитого гемоглобина в оксигенированной среде, где перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным перекрестно-сшитым тетрамерным гемоглобином, имеющим по меньшей мере 40% β-β перекрестную сшивку;

i) удаление любых остаточных химических веществ в перекрестно-сшитом тетрамерном гемоглобине;

j) термическая обработка перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде для денатурирования и осаждения любого остаточного нестабилизированного/неперекрестно-сшитого гемоглобина, любого димерного гемоглобина и любых других белковых примесей таким образом, чтобы получаемый термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин содержал неопределяемую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с β-βсшивкой по меньшей мере 40% и кислородной аффинностью больше, чем кислородная аффинность исходного гемоглобина того же вида, измеренная в существенно сходных условиях;

k) удаление осадка в перекрестно-сшитом гемоглобине путем центрифугирования или фильтрации для получения очищенного и термоустойчивого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;

l) добавление очищенного и термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина к фармацевтически приемлемому носителю.

2. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что этап термической обработки j) является высокотемпературным кратковременным (HTST) процессом, проводимым в интервале от приблизительно 70 до приблизительно 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением 0,2-0,4% N-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.

3. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что цельной кровью является бычья цельная кровь, а β-β поперечная сшивка составляет более 50% и значение р50 меньше чем приблизительно 23 мм рт.ст.

4. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что цельной кровью является бычья цельная кровь, а β-β поперечная сшивка составляет более 60% и значение р50 меньше чем приблизительно 23 мм рт.ст.

5. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что очистку на этапе g) выполняют с помощью хроматографии, в которой применяют одну или несколько катионообменных колонок или анионообменных колонок.

6. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.5, отличающийся тем, что хроматографическая колонка представляет собой одну или более диэтиламиноэтиловую колонку и/или гидроксиапатитовую колонку.

7. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что цельной кровью является человеческая кровь.

8. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что цельной кровью является свиная кровь, лошадиная кровь или собачья кровь.

9. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что этапом термической обработки j) является высокотемпературный кратковременный (HTST) процесс, проводимый при температуре от приблизительно 70 до приблизительно 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,025 до 0,4% N-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.

10. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.1, отличающийся тем, что этапом термической обработки j) является высокотемпературный кратковременный (HTST) процесс, проводимый при температуре приблизительно от 70 приблизительно до 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,025 до 0,2% N-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.

11. Высокоочищенная фармацевтическая композиция, содержащая термостабильный переносчик кислорода на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β сшивку более 40%, полученный способом по п.1.

12. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостойкий переносчик кислорода на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β сшивку более 50%, содержащий стадии:

a) предоставление цельной крови млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;

b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающего;

c) фильтрация эритроцитов, которые были отделены от плазмы, для получения фракции фильтрованных эритроцитов;

d) промывка фракции отфильтрованных эритроцитов для удаления белковых примесей из плазмы, образующихся в промываемых эритроцитах;

e) разрушение промытых эритроцитов для получения раствора, включающего в себя лизат разрушенных эритроцитов;

f) осуществление фильтрации в лизате разрушенных эритроцитов для удаления по меньшей мере части концентрата отходов из лизата для получения первого гемоглобинового раствора;

g) выполнение по меньшей мере одного процесса очистки для удаления одного или нескольких вирусов, концентрата отходов или белковых примесей для получения второго гемоглобинового раствора;

h) перекрестная сшивка второго гемоглобинового раствора бис-3,5-дибромсалицилфумаратом для получения перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, где перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным сшитым тетрамерным гемоглобином, имеющим по меньшей мере 50% β-β сшивку;

i) удаление любых остаточных химических веществ в перекрестно-сшитом тетрамерном гемоглобине;

j) термическая обработка перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде для денатурирования и осаждения любого остаточного нестабилизированного/неперекрестно-сшитого гемоглобина, любого димерного гемоглобина и любых других белковых примесей таким образом, чтобы получаемый термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин содержал неопределяемую концентрацию димера и состоял, по существу. из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с β-β сшивкой по меньшей мере 50%, имеющего кислородную аффинность меньше, чем кислородная аффинность исходного гемоглобина того же вида, измеренная в существенно сходных условиях;

k) удаление осадка в перекрестно-сшитом тетрамерном гемоглобине путем центрифугирования или фильтрации для получения очищенного и термоустойчивого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина; и

l) добавление очищенного и термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина к фармацевтически приемлемому носителю.

13. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.12, отличающийся тем, что цельной кровью является бычья цельная кровь, а кислородная аффинность перекрестно-сшитого тетрамерного бычьего гемоглобина имеет значение р50 порядка от приблизительно 38 до приблизительно 50 мм рт.ст.

14. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.13, отличающийся тем, что этапом термической обработки j) является высокотемпературный кратковременный (HTST) процесс, проводимый при температуре от приблизительно 70 приблизительно до 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,025 до 0,4% N-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.

15. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.13, отличающийся тем, что этапом термической обработки j) является высокотемпературный кратковременный (HTST) процесс, проводимый при температуре от приблизительно 70 приблизительно до 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,025 до 0,2% N-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.

16. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода по п.13, отличающийся тем, что этапом термической обработки j) является высокотемпературный кратковременный (HTST) процесс, проводимый при температуре от приблизительно 70 до приблизительно 95°С в течение от 30 с до 3 ч, с последующим немедленным охлаждением и добавлением от 0,2 до 0,4% N-ацетилцистеина непосредственно после охлаждения.

17. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода на основе гемоглобина, по существу, состоящий из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β сшивку более 40%, содержащий следующие стадии:

a) предоставление цельной крови млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;

b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающего;

c) фильтрацию эритроцитов, которые были отделены от плазмы, для получения фракции отфильтрованных эритроцитов;

d) промывка фракции фильтрованных эритроцитов для удаления белковых примесей из плазмы, образующихся в промываемых эритроцитах;

e) разрушение промытых эритроцитов для получения раствора, включающего в себя лизат разрушенных эритроцитов;

f) осуществление фильтрации для удаления в лизате разрушенных эритроцитов по меньшей мере части концентрата отходов из лизата для получения первого гемоглобинового раствора;

g) выполнение по меньшей мере одного процесса очистки для удаления одного или нескольких вирусов, концентрата отходов или белковых примесей для получения второго гемоглобинового раствора;

h) перекрестная сшивка второго гемоглобинового раствора бис-3,5-дибромсалицилфумаратом для получения перекрестно-сшитого гемоглобина в оксигенированной среде, где перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным сшитым тетрамерным гемоглобином, имеющим по меньшей мере 40% β-β сшивку;

i) удаление любых остаточных химических веществ в перекрестно-сшитом тетрамерном гемоглобине;

j) термическая обработка перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде для денатурирования и осаждения любого остаточного нестабилизированного/неперекрестно-сшитого гемоглобина, любого димерного гемоглобина и любых других белковых примесей таким образом, чтобы получаемый термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин содержал неопределяемую концентрацию димера и состоял, по существу, из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с β-β сшивкой по меньшей мере 40% и кислородной аффинностью больше, чем кислородная аффинность исходного гемоглобина того же вида, измеренная, по существу, в сходных условиях;

k) охлаждение полученного термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;

l) добавление 0,025-0,4% N-ацетилцистеина к термоустойчивому перекрестно-сшитому тетрамерному гемоглобину;

m) удаление осадка в термоустойчивом перекрестно-сшитом гемоглобине путем центрифугирования или фильтрации для получения очищенного и термоустойчивого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина и

n) добавление очищенного и термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина к фармацевтически приемлемому носителю.

18. Способ получения высокоочищенной фармацевтической композиции, содержащей термостабильный переносчик кислорода, на основе гемоглобина, который, по существу, состоит из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина, имеющего β-β сшивку более 50%, содержащий следующие стадии:

а) предоставление цельной крови млекопитающего, содержащей, по меньшей мере, эритроциты и плазму;

b) отделение эритроцитов от плазмы в цельной крови млекопитающего;

c) фильтрация эритроцитов, которые были отделены от плазмы, для получения фракции отфильтрованных эритроцитов;

d) промывка фракции фильтрованных эритроцитов для удаления плазменных белковых примесей, образующихся в промываемых эритроцитах;

e) разрушение промытых эритроцитов для получения раствора, включающего в себя лизат разрушенных эритроцитов;

f) осуществление фильтрации для удаления в лизате разрушенных эритроцитов по меньшей мере части концентрата отходов из лизата для получения первого гемоглобинового раствора;

g) выполнение по меньшей мере одного процесса очистки для удаления одного или нескольких вирусов, концентрата отходов или белковых примесей для получения второго гемоглобинового раствора;

h) перекрестная сшивка второго гемоглобинового раствора бис-3,5-дибромсалицилфумаратом для получения перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде, где перекрестно-сшитый гемоглобин является неполимерным сшитым тетрамерным гемоглобином, имеющим по меньшей мере 50% β-β сшивку;

i) удаление любых остаточных химических веществ в перекрестно-сшитом тетрамерном гемоглобине;

j) термическая обработка перекрестно-сшитого гемоглобина в дезоксигенированной среде для денатурирования и осаждения любого остаточного нестабилизированного/неперекрестно-сшитого гемоглобина, любого димерного гемоглобина и любых других белковых примесей таким образом, чтобы получаемый термостойкий перекрестно-сшитый тетрамерный гемоглобин содержал неопределяемую концентрацию димера и состоял преимущественно из неполимерного перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина с β-β сшивкой по меньшей мере 50%, имеющего кислородную аффинность меньше, чем кислородная аффинность исходного гемоглобина того же вида, измеренная, по существу. в сходных условиях;

k) охлаждение полученного термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина;

l) добавление 0,025-0,4% N-ацетилцистеина к термоустойчивому перекрестно-сшитому тетрамерному гемоглобину;

m) удаление осадка в термоустойчивом перекрестно-сшитом гемоглобине путем центрифугирования или фильтрации для получения очищенного и термоустойчивого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина,

n) добавление очищенного и термостойкого перекрестно-сшитого тетрамерного гемоглобина к фармацевтически приемлемому носителю.