Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"Бюллетень 06´2016

Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 06´2016

(11)	023565 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	201290716
(22)	2011.01.26
(51)	*C12Q 1/68* (2006.01)
(31)	61/298,339; 61/405,421
(32)	2010.01.26; 2010.10.21
(33)	US
(43)	2013.06.28
(86)	PCT/IB2011/000217
(87)	WO 2011/092592 2011.08.04
(71)	(73) ЭнАйПиДи ДЖЕНЕТИКС ЛТД. (CY)
(72)	Пацалис Филиппос К., Папагеоргиу Элизавет А. (CY)
(74)	Медведев В.Н. (RU)
(54)	СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ АНЕУПЛОИДИИ ПЛОДА

(57) 1. Способ пренатальной диагностики трисомии 21 хромосомы с использованием образца крови матери, включающий:

а) физическое отделение гиперметилированной ДНК от гипометилированной ДНК без химического изменения или ферментативного расщепления гипометилированной ДНК или гиперметилированной ДНК в образце материнской крови для получения образца гиперметилированной ДНК;

б) определение уровней множества дифференциально метилированных участков (ДМУ) в образце гиперметилированной ДНК с получением значения гиперметилирования для образца гиперметилированной ДНК, где по меньшей мере один из ДМУ содержит участок, выбранный из пар оснований 39279856-39280004 (SEQ ID NO: 33), пар оснований 44161178-44161323 (SEQ ID NO: 34), пар оснований 33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36), пар оснований 42189557-42189683 (SEQ ID NO: 37), пар оснований 42355712-42355815 (SEQ ID NO: 38), пар оснований 42357215-42357341 (SEQ ID NO: 39), пар оснований 32268843-32268943 (SEQ ID NO: 42) и пар оснований 37841284-37841411 (SEQ ID NO: 44);

в) сравнение значения гиперметилирования образца гиперметилированной ДНК со стандартизированным эталонным значением гиперметилирования для указанного множества ДМУ и

г) диагностику трисомии 21 хромосомы на основе указанного сравнения.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец крови матери представлен образцом периферической крови матери или фракционированной частью периферической крови матери.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что гиперметилированная ДНК отделяется от гипометилированной ДНК с использованием антитела, которое иммунопреципитирует метилированную ДНК

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что множество ДМУ выбирают из списков, представленных в Приложении А.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что уровни множества ДМУ определяют по меньшей мере для трех, пяти, восьми или десяти ДМУ.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что уровни множества ДМУ в образце гиперметилированной ДНК определяют путем количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (КПЦР в режиме реального времени).

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что значение гиперметилирования для образца гиперметилированной ДНК сравнивают со стандартизированным нормальным эталонным значением гиперметилирования образца ДНК крови здоровой матери и диагноз анеуплоидии плода ставят, когда значение гиперметилирования для образца гиперметилированной ДНК выше, чем стандартизированное нормальное эталонное значение гиперметилирования для образца ДНК крови здоровой матери.

8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что множество ДМУ находится на хромосоме 21 и включает:

(а) три или более участка, выбранных из группы, состоящей из пар оснований 39279856-39280004 (SEQ ID NO: 33), пар оснований 44161178-44161323 (SEQ ID NO: 34), пар оснований 44161239-44161371 (SEQ ID NO: 35), пар оснований 33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36), пар оснований 42189557-42189683 (SEQ ID NO: 37), пар оснований 42355712-42355815 (SEQ ID NO: 38), пар оснований 42357215-42357341 (SEQ ID NO: 39), пар оснований 22403649-22403792 (SEQ ID NO: 40), пар оснований 29136735-29136844 (SEQ ID NO: 41), пар оснований 32268843-32268943 (SEQ ID NO: 42), пар оснований 44079235-44079322 (SEQ ID NO: 43), пар оснований 37841284-37841411 (SEQ ID NO: 44) и их комбинаций;

(б) восемь или более участков, выбранных из группы, состоящей из пар оснований 39279856-39280004 (SEQ ID NO: 33), пар оснований 44161178-44161323 (SEQ ID NO: 34), пар оснований 44161239-44161371 (SEQ ID NO: 35), пар оснований 33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36), пар оснований 42189557-42189683 (SEQ ID NO: 37), пар оснований 42355712-42355815 (SEQ ID NO: 38), пар оснований 42357215-42357341 (SEQ ID NO: 39), пар оснований 22403649-22403792 (SEQ ID NO: 40), пар оснований 29136735-29136844 (SEQ ID NO: 41), пар оснований 32268843-32268943 (SEQ ID NO: 42), пар оснований 44079235-44079322 (SEQ ID NO: 43), пар оснований 37841284-37841411 (SEQ ID NO: 44) и их комбинаций; или

(в) восемь участков с нуклеотидными последовательностями пары оснований 33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36), пары оснований 42189557-42189683 (SEQ ID NO: 37), пары оснований 42355712-42355815 (SEQ ID NO: 38), пары оснований 42357215-42357341 (SEQ ID NO: 39), пары оснований 22403649-22403792 (SEQ ID NO: 40), пары оснований 32268843-32268943 (SEQ ID NO: 42), пары оснований 44079235-44079322 (SEQ ID NO: 43) и пары оснований 37841284-37841411 (SEQ ID NO: 44).

9. Способ пренатальной диагностики трисомии 21 хромосомы с использованием образца периферической крови матери, включающий:

а) физическое отделение гиперметилированной ДНК от гипометилированной ДНК в образце материнской периферической крови без химического изменения или ферментативного расщепления гипометилированной ДНК или гиперметилированной ДНК для получения образца гиперметилированной ДНК;

б) определение уровней множества дифференциально метилированных участков (ДМУ) на хромосоме 21 в образце гиперметилированной ДНК с получением значения гиперметилирования для образца гиперметилированной ДНК,

при этом множество ДМУ на хромосоме 21 включает восемь или более участков, выбранных из группы, состоящей из пар оснований 39279856-39280004 (SEQ ID NO: 33), пар оснований 44161178-44161323 (SEQ ID NO: 34), пар оснований 33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36), пар оснований 42189557-42189683 (SEQ ID NO: 37), пар оснований 42355712-42355815 (SEQ ID NO: 38), пар оснований 42357215-42357341 (SEQ ID NO: 39), пар оснований 32268843-32268943 (SEQ ID NO: 42) и пар оснований 37841284-37841411 (SEQ ID NO: 44) и их комбинаций; и

уровни множества ДМУ определяют количественной полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (КПЦР в режиме реального времени);

в) сравнение значения гиперметилирования образца гиперметилированной ДНК со стандартизированным нормальным эталонным значением гиперметилирования для указанного множества ДМУ на хромосоме 21 и

г) диагностику трисомии 21 хромосомы на основе указанного сравнения.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гиперметилированная ДНК физически отделяется от гипометилированной ДНК путем иммунопреципитации метилированной ДНК (MeDiP).

11. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что после физического отделения гиперметилированной ДНК от гипометилированной ДНК, гиперметилированная ДНК амплифицируется.

12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что гиперметилированная ДНК амплифицируется путем опосредованной лигированием полимеразной цепной реакции (ОЛ-ПЦР).

13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что уровни множества ДМУ также определены в общем образце не подвергнутой обработке ДНК крови матери в качестве контроля эффективности ОЛ-ПЦР.

14. Способ по п.9, отличающийся тем, что значение гиперметилирования для образца гиперметилированной ДНК сравнивают со стандартизированным нормальным эталонным значением гиперметилирования образца ДНК крови здоровой матери и диагноз трисомии 21 хромосомы ставится, когда значение гиперметилирования для образца гиперметилированной ДНК выше, чем стандартизированное нормальное эталонное значение гиперметилирования для образца ДНК крови здоровой матери.

15. Способ по п.9, отличающийся тем, что множество ДМУ на хромосоме 21 включает восемь участков с нуклеотидными последовательностями пары оснований 33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36), пары оснований 42189557-42189683 (SEQ ID NO: 37), пары оснований 42355712-42355815 (SEQ ID NO: 38), пары оснований 42357215-42357341 (SEQ ID NO: 39), пары оснований 22403649-22403792 (SEQ ID NO: 40), пары оснований 32268843-32268943 (SEQ ID NO: 42), пары оснований 44079235-44079322 (SEQ ID NO: 43) и пары оснований 37841284-37841411 (SEQ ID NO: 44).

16. Набор для пренатальной диагностики трисомии 21 хромосомы для применения в способе по любому из пп.1-15, включающий:

а) две или несколько композиции нуклеиновых кислот для определения уровней множества дифференциально метилированных участков (ДМУ) на хромосоме 21, где по меньшей мере один из ДМУ содержит участок, выбранный из пар оснований 39279856-39280004 (SEQ ID NO: 33), пар оснований 44161178-44161323 (SEQ ID NO: 34), пар оснований 33320735-33320829 (SEQ ID NO: 36), пар оснований 42189557-42189683 (SEQ ID NO: 37), пар оснований 42355712-42355815 (SEQ ID NO: 38), пар оснований 42357215-42357341 (SEQ ID NO: 39), пар оснований 32268843-32268943 (SEQ ID NO: 42) и пар оснований 37841284-37841411 (SEQ ID NO: 44); и

б) инструкции по использованию композиций нуклеиновых кислот для пренатальной диагностики трисомии 21 хромосомы.

17. Набор по п.16, отличающийся тем, что множество ДМУ на 21 хромосоме выбирают из списков, представленных в Приложении А.

18. Набор по п.16, отличающийся тем, что множество ДМУ на хромосоме 21 включает:

19. Набор по любому из пп.16-18, отличающийся тем, что композиции нуклеиновой кислоты включают одну или более пар олигонуклеотидных праймеров, выбранных из группы, состоящей из

GCTGGACCAGAAAGTGTTGAG (SEQ ID NO: 1) и GTGTGCTGCTTTGCAATGTG (SEQ ID NO: 2),

GGTCGAGTTTTTGGTGGTGT (SEQ ID NO: 3) и CCACCGTCACTGTTCCTAGA (SEQ ID NO: 4),

CCTCGTGCTCGTGTCTGTAT (SEQ ID NO: 5) и GAGGAAACAGCTTGGCTCTG (SEQ ID NO: 6),

CTGTTGCATGAGAGCAGAGG (SEQ ID NO: 7) и CGTCCCCCTCGCTACTATCT (SEQ ID NO: 8),

TGCAGGATATTTGGCAAGGT (SEQ ID NO: 9) и CTGTGCCGGTAGAAATGGTT (SEQ ID NO: 10),

TGAATCAGTTCACCGACAGC (SEQ ID NO: 11) и GAAACAACCTGGCCATTCTC (SEQ ID NO: 12),

CCGTTATATGGATGCCTTGG (SEQ ID NO: 13) и AAACTGTTGGGCTGAACTGC (SEQ ID NO: 14),

CCAGGCAAGATGGCTTATGT (SEQ ID NO: 15) и ACCATGCTCAGCCAATTTTT (SEQ ID NO: 16),

GACCCAGACGATACCTGGAA (SEQ ID NO: 17) и GCTGAACAAAACTCGGCTTC (SEQ ID NO: 18),

CCACATCCTGGCCATCTACT (SEQ ID NO: 19) и TTCCACAGACAGCAGAGACG (SEQ ID NO: 20),

TGAGCTCACAGGTCTGGAAA (SEQ ID NO: 21) и CCCCACAGGGTTCTGGTAAT (SEQ ID NO: 22),

ATTCTCCACAGGGCAATGAG (SEQ ID NO: 23) и TTATGTGGCCTTTCCTCCTG (SEQ ID NO: 24)

и их комбинаций.

20. Набор по любому из пп.16-19, отличающийся тем, что набор дополнительно включает средства для физического отделения гиперметилированной ДНК от гипометилированной ДНК без химического изменения или ферментативного расщепления гиперметилированной ДНК или гипометилированной ДНК в образце крови.

21. Набор по п.20, отличающийся тем, что способы для физического отделения гиперметилированной ДНК от гипометилированной ДНК включают антитело, которое иммунопреципитирует метилированную ДНК.

22. Набор по п.20, отличающийся тем, что он дополнительно включает способы амплификации гиперметилированной ДНК.

23. Набор по п.22, отличающийся тем, что способы амплификации гиперметилированной ДНК включают олигонуклеотидные линкеры или олигонуклеотидные праймеры для проведения опосредованной лигированием полимеразной цепной реакции (ОЛ-ПЦР).

наверх