(11)	021064 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	200970996
(22)	2008.04.23
(51)	A61K 39/145 (2006.01)
(31)	07300979.7
(32)	2007.04.24
(33)	EP
(43)	2010.04.30
(86)	PCT/EP2008/054912
(87)	WO 2008/129058 2008.10.30
(71)	(73) ВАЛЬНЕВА (FR)
(72)	Жеэне Фабьен, Моро Карин, Эсно Магали, Метали Мажид (FR)
(74)	Липатова И.И., Рыбаков В.М., Новоселова С.В., Дощечкина В.В., Хмара М.В. (RU)
(54)	НЕПРЕРЫВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ СТАБИЛЬНЫЕ ПТИЧЬИ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ ЭМБРИОНОВ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВИРУСНЫХ ВАКЦИН, РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

(57) 1. Способ получения непрерывных генетически стабильных птичьих клеточных линий, полученных из птичьих эмбриональных стволовых клеток (ES) и способных к пролиферации в основной среде в отсутствие факторов роста и фидерного слоя, характеризующихся тем, что указанные птичьи клеточные линии не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц, и где указанный способ включает следующие этапы:

a) выделение птичьего эмбриона(ов) на стадии развития примерно в период откладки яиц, где геном указанной птицы не содержит эндогенные провирусные последовательности, допускающие продукцию способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц;

b) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых клеток (ES), полученных путем диссоциации эмбриона(ов) на этапе а) в основной культуральной среде, дополненной

инсулиновым фактором роста 1 (IGF-1) и цилиарным нейротрофическим фактором (CNTF);

животной сывороткой;

c) посев суспензии ES-клеток, полученной на этапе b), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ES-клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

d) выведение IGF-1 и CNTF из культуральной среды и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;

e) постепенное уменьшение концентрации фидерных клеток в культуральной среде, дающее полное выведение фидерного слоя после нескольких пассажей, с получением непрерывных генетически стабильных птичьих клеточных линий.

2. Способ по п.1, в котором дополнительно на стадии е) концентрация животной сыворотки в культуральной среде постепенно уменьшается, с тем чтобы получить полное выведение животной сыворотки через несколько пассажей.

3. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором указанные прикрепленные птичьи клеточные линии адаптированы к условиям культивирования в суспензии.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором выведение IGF-1 и CNTF из культуральной среды на стадии d) производится одновременно.

5. Способ по любому из пп.1-4, где указанная птица выбрана из отряда Гусеобразные.

6. Способ по п.5, где указанная птица является уткой.

7. Способ по п.6, где указанная утка является пекинской уткой.

8. Способ по п.6, где указанная утка является мускусной уткой.

9. Способ по п.8, где яйцо указанной мускусной утки инкубируют до зрелости перед изолированием утиного эмбриона.

10. Способ по любому из пп.1-4, где указанная птица выбрана из отряда Курообразные.

11. Способ по п.10, где указанная птица является линией домашней курицы, не содержащей полных ALV-E-провирусных последовательностей.

12. Непрерывная генетически стабильная птичья клеточная линия, полученная способом по пп.1-11, где клетки указанной птичьей клеточной линии обладают по меньшей мере одной из следующих характеристик:

высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением;

эндогенной теломеразной активностью;

диаметром примерно 10 мкм;

временем удвоения популяции примерно 30 ч или менее при 37°С;

и где указанные клетки не продуцируют способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц.

13. Птичья клеточная линия по п.12, где клетки указанной птичьей клеточной линии дополнительно экспрессируют один или более маркер, выбранный из группы, включающей щелочную фосфатазу, SSEA-1, ЕМА-1, ENS-1.

14. Способ репликации вируса в непрерывной генетически стабильной птичьей клеточной линии по п.12 или 13 или полученной в способе по одному из пп.1-11, включающий следующие этапы:

a) инфицирование указанных птичьих клеток интересующим вирусом;

b) культивирование указанных инфицированных птичьих клеток с целью репликации указанного вируса;

c) сбор вируса в клеточном культуральном супернатанте и/или внутри указанных клеток.

15. Способ по п.14, в котором указанный вирус выбран из группы, включающей поксвирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы, вирусы герпеса, вирусы гепатита, аденовирусы, парвовирусы, реовирусы, цирковирусы, коронавирусы, флавивирусы, тогавирусы, бирнавирусы и ретровирусы.

16. Способ по п.15, где вирус представляет собой поксвирус или рекомбинантный поксвирус, выбранный из группы, включающей вирус осповакцины штамма Анкара (MVA), вакцинный вирус Листера-Элстри, вакцинный вирус LC16m8, вакцинный вирус CVI78, вирус оспы птиц, вирус оспы канареек (т.е. ALVAC), NYVAC, вирус оспы юнко, вирус оспы майны, вирус оспы голубя, вирус оспы попугаев, вирус оспы перепелов, вирус оспы воробьев, вирус оспы скворцов, вирус оспы индеек.

17. Способ по п.15, где вирус представляет собой парамиксовирус или рекомбинантный парамиксовирус, предпочтительно выбранный из группы, включающей вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус краснухи, вирус Сендай, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус человеческого парагриппа I и III типов, вирус чумы крупного рогатого скота, вирус собачьей чумки, вирус болезни Ньюкасла, вирус утиного парагриппа.

18. Способ по п.15, где вирус представляет собой ортомиксовирус, рекомбинантный ортомиксовирус или химерный ортомиксовирус, выбранный среди вируса человеческого гриппа, вируса птичьего гриппа, вируса свиного гриппа, вируса лошадиного гриппа, вируса кошачьего гриппа.

19. Способ по п.15, где вирус представляет собой тогавирус, предпочтительно выбранный среди вируса Синдбис, вируса леса семлики, вируса лихорадки О'Ньонг-Ньонг, вируса чикунгуньи, вируса Майяро, вируса реки Росс, вируса восточного лошадиного энцефалита, вируса западного лошадиного энцефалита, вируса венесуэльского лошадиного энцефалита или этих рекомбинантных вирусов.

20. Способ по п.15, где вирус представляет собой ретровирус, выбранный среди вируса ретикулоэндотелиоза, вируса инфекционной анемии уток, вируса некроза селезенки уток или этих рекомбинантных вирусов.

21. Способ по п.15, где вирус представляет собой парвовирус, предпочтительно утиный парвовирус или рекомбинантный парвовирус.

22. Способ по п.15, где вирус представляет собой аденовирус, предпочтительно выбранный среди аденовируса птиц, аденовируса гусей, аденовируса уток и аденовируса голубей или этих рекомбинантных аденовирусов.

23. Способ по п.15, где вирус представляет собой бирнавирус, предпочтительно вирус инфекционного бурсита.

24. Способ по п.15, где вирус представляет собой флавивирус, предпочтительно выбранный среди вируса лихорадки денге, вируса японского энцефалита и вируса Западного Нила.

25. Вирусный препарат, характеризующийся тем, что он содержит вирус, полученный способом по одному из пп.14-24, и не содержит способных к репликации эндогенных ретровирусных частиц.

26. Вакцина для профилактики вирусных инфекций, содержащая вирусный препарат по п.25, при необходимости в комбинации с фармацевтически приемлемыми веществами, которые усиливают иммунный ответ.

27. Вакцина по п.26, где вирус выбирают из группы, включающей вирус, присутствующий в виде интактных вирусных частиц, и вирус, присутствующий в виде дезинтегрированных вирусных частиц.

28. Вакцина, содержащая по меньшей мере один вирусный антигенный белок, полученный из вирусного препарата по п.25, при необходимости в комбинации с фармацевтически приемлемыми веществами, которые усиливают иммунный ответ.

29. Вакцина для профилактики вирусных инфекций, содержащая птичьи клетки, полученные из птичьих клеточных линий по п.12 или 13 или полученные в способе по одному из пп.1-11 и инфицированные вирусом.

30. Способ производства рекомбинантных белков и пептидов, который включает этапы:

(а) генетической модификации непрерывной генетически стабильной птичьей клеточной линии по пп.12 или 13 или полученной в способе по одному из пп.1-11 путем временной или стабильной трансфекции вектора экспрессии, кодирующего указанные белки и пептиды;

(b) выбора указанной модифицированной непрерывной генетически стабильной птичьей клеточной линии, экспрессирующей указанные рекомбинантные белки или пептиды; и

(с) очистки рекомбинантных пептидов или белков, экспрессирующихся указанной генетически модифицированной непрерывной генетически стабильной птичьей клеточной линией.