Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"Бюллетень 9´2014

Бюллетень ЕАПВ "Изобретения (евразийские заявки и евразийские патенты)"
Бюллетень 9´2014

(11)	020145 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	201170388
(22)	2009.08.28
(51)	*C07H 21/00* (2006.01) *C12N 15/00* (2006.01)
(31)	12/202,119
(32)	2008.08.29
(33)	US
(43)	2011.10.31
(86)	PCT/US2009/055412
(87)	WO 2010/025395 2010.03.04
(71)	(73) ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. (NL)
(72)	Бартон Нельсон Р., Буэно Аналиа, Куэнка Джослин, Хитчмэн Тим, Клайн Кэти А., Лайон Джонатан, Миллер Марк Л., Уолл Марк А., Дейтон Кристофер Л.Г. (US)
(74)	Воробьева Е.В. (RU)
(54)	ГИДРОЛАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

(57) 1. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая:

(а) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, где нуклеиновая кислота включает последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более либо полной (100%) идентичностью последовательности с нуклеиновой кислотой SEQ ID NO:1,

имеющая по меньшей мере одну замену нуклеотида (или эквивалент), кодирующую аминокислотную замену V163R (или ее эквивалент),

где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, или кодирует полипептид или пептид, способные генерировать образование антитела, специфичного к гидролазе (полипептид или пептид, которые действуют в качестве эпитопа или иммуногена);

(b) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 или более остатков или полной длины кДНК, транскрипта (мРНК) или гена;

(c) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (а) или (b), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм BLAST версии 2.2.2, где фильтрация устанавливается как blastall -p blastp -d "nr pataa" -FF и все другие опции устанавливаются по умолчанию;

(d) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид или пептид, обладающие гидролазной активностью, где нуклеиновая кислота включает последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с комплементом нуклеиновой кислоты из (а), (b) или (с), где жесткие условия включают стадию промывки, включающую промывку в 0,2Х SSC при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин;

(e) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной, например липазной, сатуразной, пальмитазной и/или стеаратазной, активностью, где полипептид включает последовательность SEQ ID NO:2 или ее ферментативно активные фрагменты, имеющие, по меньшей мере, аминокислотную замену V163R (или ее эквивалент);

(f) (А) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (а)-(е), кодирующую полипептид, содержащий по меньшей мере одну консервативную замену аминокислоты и сохраняющий свою гидролазную активность, или (В) нуклеиновую кислоту по (f) (А), где по меньшей мере одна консервативная замена аминокислоты включает замену аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками или консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком;

(g) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (a)-(f), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, но не имеющий сигнальной последовательности;

(h) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по любому из (a)-(g), кодирующую полипептид, обладающий гидролазной активностью, дополнительно включающий гетерологичную последовательность;

(i) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) по (h), где гетерологичная последовательность включает последовательность, кодирующую (А) гетерологичную сигнальную последовательность, (В) последовательность по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, или (С) метку, эпитоп, направляющий пептид, расщепляемую последовательность, определяемую часть или фермент, или состоит из нее; или

(j) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), полностью (целиком) комплементарную последовательности по любому из (a)-(j).

2. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность включает липазную активность, сатуразную, стеаратазную или пальмитазную активность,

где, необязательно, сатуразная активность включает избирательный гидролиз по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сложных эфиров насыщенных жирных кислот, где, необязательно, гидролизуемые сложные эфиры могут представлять собой сложные эфиры насыщенных жирных кислот и глицерина, умбеллиферола или других спиртов,

где, необязательно, пальмитазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту, или

где, необязательно, стеаратазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой стеариновую кислоту.

3. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность включает:

(a) гидролиз триацилглицерина до диацилглицерина и свободной жирной кислоты, или гидролиз триацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз диацилглицерина до моноацилглицерина и свободных жирных кислот, или гидролиз моноацилглицерина до свободной жирной кислоты и глицерина, или гидролиз триацилглицерина (TAG), диацилглицерина (DAG) или моноацилглицерина (MAG);

(b) синтез триацилглицерина из диацилглицерина или моноацилглицерина и свободных жирных кислот;

(c) синтез 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (POP), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерина (SOS), 1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерина (POS) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерина (ОММ), длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, арахидоновой кислоты, докозагексаеновой кислоты (DHA) или эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА);

(d) гидролазную активность, которая специфична в отношении положения триацилглицерина (TAG), диацилглицерина (DAG) или моноацилглицерина (MAG), где, необязательно, гидролазная активность является Sn2-специфичной, Sn1- или Sn3-специфичной;

(e) гидролазную активность, которая специфична в отношении жирной кислоты, где, необязательно, жирная кислота представляет собой пальмитиновую, стеариновую или другую насыщенную жирную кислоту;

(f) модификацию масел путем гидролиза, алкоголиза, этерификации, трансэтерификации или переэтерификации;

(g) гидролазную активность, которая является региоспецифичной или химиоселективной, где, необязательно, гидролазная активность включает синтез энантиомерно чистых хиральных продуктов; или

(h) синтез умбеллифериловых сложных эфиров жирных кислот (ЖК).

4. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность является термостабильной, где, необязательно, полипептид сохраняет липазную активность в условиях, включающих диапазон температуры от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно
-80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.

5. Выделенная синтетическая или рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.1, где гидролазная активность является термоустойчивой, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность после экспозиции при температуре в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.

6. Экспрессионная кассета, вектор или носитель для клонирования, включающие нуклеиновую кислоту, включающую последовательность по п.1, где, необязательно, носитель для клонирования включает вирусный вектор, плазмиду, фаг, фагмиду, космиду, фосмиду, бактериофаг или искусственную хромосому, где, необязательно, вирусный вектор включает аденовирусный вектор, ретровирусный вектор или ассоциированный с аденовирусом вирусный вектор, и, необязательно, носитель для клонирования включает бактериальную искусственную хромосому (ВАС), плазмиду, вектор, происходящий из бактериофага Р1 (РАС), искусственную хромосому дрожжей (YAC) или искусственную хромосому млекопитающих (MAC).

7. Трансформированная клетка, включающая нуклеиновую кислоту, включающую последовательность по п.1, или экспрессионная кассета, вектор или носитель для клонирования по п.6, где, необязательно, клетка представляет собой бактериальную клетку, клетку млекопитающего, клетку гриба, клетку дрожжей, клетку насекомого или клетку растения.

8. Трансгенное животное, отличное от человека, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, животное представляет собой мышь.

9. Трансгенное растение, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, растение представляет собой растение кукурузы, растение сорго, растение картофеля, растение томата, растение пшеницы, растение масличной культуры, растение рапса, растение сои, растение риса, растение ячменя, траву или растение табака.

10. Трансгенное семя, включающее последовательность по п.1, где, необязательно, семя представляет собой рис, семя кукурузы, зерно пшеницы, семя масличной культуры, семя рапса, семя сои, зерно пальмы, семя подсолнечника, семя кунжута, рис, ячмень, арахис или семя растения табака.

11. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид, включающий:

(а) последовательность, обладающую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или 100% (полной) идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или ее ферментативно активными фрагментами и содержащую, по меньшей мере, аминокислотную замену V163R (или ее эквивалент), или где полипептид или пептид обладают гидролазной активностью или полипептид или пептид способны генерировать образование антитела, специфичного в отношении гидролазы (полипептид или пептид, которые действуют в качестве эпитопа или иммуногена);

(b) последовательность полипептида или пептида по (а), где идентичности последовательностей определены (А) путем анализа с помощью алгоритма сравнения последовательностей или визуального обследования или (В) на протяжении области по меньшей мере из приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 или более аминокислотных остатков либо на протяжении полной длины полипептида или пептида либо фермента и/или их ферментативно активных подпоследовательностей (фрагментов);

(c) последовательность полипептида или пептида по (b), где алгоритмом сравнения последовательностей является алгоритм BLAST версии 2.2.2, где фильтрация устанавливается как blastall -p blastp -d "nr pataa" -FF и все другие опции устанавливаются по умолчанию;

(d) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1, где полипептид обладает (i) гидролазной активностью или (ii) иммуногенной активностью в том плане, что он способен генерировать образование антитела, которое специфически связывается с полипептидом, обладающим последовательностью по (а) и/или его ферментативно активными подпоследовательностями (фрагментами);

(e) аминокислотную последовательность по любому из (a)-(d), включающую по меньшей мере одну консервативную замену аминокислотного остатка и где полипептид или пептид сохраняют гидролазную активность;

(f) аминокислотную последовательность по (е), где консервативная замена включает замену алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином и наоборот; замену кислого остатка другим кислым остатком; замену остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену основного остатка другим основным остатком или замену ароматического остатка другим ароматическим остатком или их сочетание;

(g) аминокислотную последовательность по (f), где алифатический остаток включает аланин, валин, лейцин, изолейцин или их синтетический эквивалент; кислый остаток включает аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или их синтетический эквивалент; остаток, включающий амидную группу, включает аспарагин, глутамин или их синтетический эквивалент; основной остаток включает лизин, аргинин, гистидин или их синтетический эквивалент или ароматический остаток включает фенилаланин, тирозин, триптофан или их синтетический эквивалент;

(h) последовательность полипептида по любому из (a)-(f), обладающего гидролазной активностью, но лишенного сигнальной последовательности;

(i) последовательность полипептида по любому из (a)-(h), обладающего гидролазной активностью и дополнительно включающего гетерологичную последовательность;

(j) последовательность полипептида по (i), где гетерологичная последовательность включает (А) гетерологичную сигнальную последовательность, (В) последовательность по (А), где гетерологичная сигнальная последовательность происходит от гетерологичного фермента, и/или (С) метку, эпитоп, направляющий пептид, расщепляемую последовательность, обнаруживаемую часть или фермент, или состоит из нее; или

(m) аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой по п.1.

12. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает липазную активность, сатуразную, стеаратазную или пальмитазную активность, где, необязательно, сатуразная активность включает избирательный гидролиз по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% сложных эфиров насыщенных жирных кислот, где, необязательно, гидролизуемые сложные эфиры могут представлять собой сложные эфиры насыщенных жирных кислот и глицерина, умбеллиферола или других спиртов, где, необязательно, пальмитазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой пальмитиновую кислоту, или где, необязательно, стеаратазная активность включает избирательный гидролиз жирных кислот, так что по меньшей мере 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% гидролизуемых жирных кислот представляют собой стеариновую кислоту.

13. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает:

(b) синтез триацилглицерина из диацилглицерина или моноацилглицерина и свободных жирных кислот;

(c) синтез 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (POP), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерина (SOS),
1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерина (POS) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерина (ОММ), длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот, арахидоновой кислоты, докозагексаеновой кислоты (DHA) или эйкозапентаеновой кислоты (ЕРА);

(d) гидролазную активность, которая специфична для положений триацилглицерина (TAG), диацилглицерина (DAG) или моноацилглицерина (MAG), где, необязательно, гидролазная активность является Sn-специфичной, Sn1- или Sn3-специфичной;

(e) гидролазную активность, которая специфична для жирных кислот, где, необязательно, жирная кислота представляет собой пальмитиновую, стеариновую или другую насыщенную жирную кислоту;

(f) модификацию масел путем гидролиза, алкоголиза, этерификации, трансэтерификации или переэтерификации;

(h) синтез умбеллифериловых сложных эфиров жирных кислот (ЖК).

14. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность является термостабильной, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность в условиях, включающих диапазон температуры от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно
-80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.

15. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность является термоустойчивой, где, необязательно, полипептид сохраняет гидролазную активность после экспозиции при температуре в диапазоне от приблизительно -100 до приблизительно -80°С, от приблизительно -80 до приблизительно -40°С, от приблизительно -40 до приблизительно -20°С, от приблизительно -20 до приблизительно 0°С, от приблизительно 0 до приблизительно 5°С, от приблизительно 5 до приблизительно 15°С, от приблизительно 15 до приблизительно 25°С, от приблизительно 25 до приблизительно 37°С, от приблизительно 37 до приблизительно 45°С, от приблизительно 45 до приблизительно 55°С, от приблизительно 55 до приблизительно 70°С, от приблизительно 70 до приблизительно 75°С, от приблизительно 75 до приблизительно 85°С, от приблизительно 85 до приблизительно 90°С, от приблизительно 90 до приблизительно 95°С, от приблизительно 95 до приблизительно 100°С, от приблизительно 100 до приблизительно 105°С, от приблизительно 105 до приблизительно 110°С, от приблизительно 110 до приблизительно 120°С или 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115°С или более.

16. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где гидролазная активность включает специфичную активность приблизительно при 37°С в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка, от приблизительно 500 до приблизительно 750 ед/1 мг белка, от приблизительно 500 до приблизительно 1200 ед/1 мг белка или от приблизительно 750 до приблизительно 1000 ед/1 мг белка.

17. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где полипептид включает по меньшей мере один сайт гликозилирования, где, необязательно, гликозилирование может представлять собой N-связанное гликозилирование, и, необязательно, полипептид гликозилирован после экспрессии в
P. pastoris или S. pombe.

18. Выделенный синтетический или рекомбинантный полипептид по п.11, где полипептид сохраняет гидролазную активность в условиях, включающих рН 3,0, приблизительно рН 3,5, приблизительно рН 4,0, приблизительно рН 4,5, приблизительно рН 5,0, приблизительно рН 5,5, приблизительно рН 6,0, приблизительно рН 6,5, приблизительно рН 7,0, приблизительно рН 7,5, приблизительно рН 8,0, приблизительно рН 8,5, приблизительно рН 9,0, приблизительно рН 9,5, приблизительно рН 10,0, приблизительно рН 10,5, приблизительно рН 11,0, приблизительно рН 11,5, приблизительно рН 12,0 или выше.

19. Препарат белка, включающий полипептид по п.11, где препарат белка включает жидкость, твердое вещество или гель.

20. Гетеродимер, включающий полипептид по п.11, и второй домен, где, необязательно, второй домен представляет собой полипептид и гетеродимер представляет собой слитый белок или второй домен представляет собой эпитоп или метку.

21. Гомодимер, включающий полипептид по п.11.

22. Иммобилизованный полипептид, где полипептид включает последовательность по п.11 или ее подпоследовательность, где, необязательно, полипептид иммобилизован на клетке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитовой частице, шарике, геле, планшете, матрице или капиллярной трубке.

23. Матрица, включающая (i) иммобилизованный полипептид по п.11.

24. Выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.11, где, необязательно, антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.

25. Гибридома, включающая антитело, которое специфически связывается с полипептидом по п.11.

26. Пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция, включающие полипептид по п.11 или его подпоследовательность, где, необязательно, полипептид гликозилирован.

27. Матрица для доставки пригодного в пищу фермента, включающая полипептид по п.11, где, необязательно, матрица для доставки включает гранулу и, необязательно, полипептид гликозилирован или полипептид обладает термоустойчивой или термостабильной гидролазной активностью.

28. Способ получения рекомбинантного полипептида, включающий стадии (а) обеспечения нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где нуклеиновая кислота включает последовательность по п.1; и (b) экспрессии нуклеиновой кислоты со стадии (а) в условиях, которые обеспечивают экспрессию полипептида, с получением тем самым рекомбинантного полипептида, где, необязательно, способ дополнительно включает трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой со стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты со стадии (а), с получением тем самым рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке.

29. Способ идентификации полипептида, обладающего гидролазной активностью, включающий следующие стадии:

(a) обеспечение полипептида по п.11,

(b) обеспечение субстрата гидролазы,

(c) приведение полипептида в контакт с субстратом со стадии (b) и определение снижения количества субстрата или роста количества продукта реакции, где снижение количества субстрата или рост количества продукта реакции указывает на полипептид, обладающий гидролазной активностью, где, необязательно, субстрат представляет собой жирную кислоту, триацилглицерин (TAG), диацилглицерин (DAG) или моноацилглицерин (MAG).

30. Способ повышения термоустойчивости или термостабильности гидролазного полипептида, причем способ включает гликозилирование гидролазного полипептида, где полипептид включает по меньшей мере тридцать последовательных аминокислот полипептида по п.11, чем повышается термоустойчивость или термостабильность гидролазного полипептида, где, необязательно, специфическая гидролазная активность является термостабильной или термоустойчивой при температуре в диапазоне выше чем от приблизительно -100 до приблизительно 115°С.

31. Композиция детергента, включающая полипептид по п.11, где полипептид включает гидролазную активность, где, необязательно, гидролаза представляет собой не поверхностно-активную гидролазу или поверхностно-активную гидролазу или, необязательно, гидролазу составляют в виде неводной жидкой композиции, литой твердой формы, гранулированной формы, в форме частиц, в форме прессованной таблетки, в форме геля, порошка, геля, гидрогеля, липосомы, аэрозоля, пасты или в форме суспензии.

32. Способ мытья объекта, включающий следующие стадии:

(a) обеспечение композиции, включающей полипептид, обладающий гидролазной активностью, где полипептид включает полипептид по п.11;

(b) обеспечение объекта;

(с) приведение полипептида со стадии (а) и объекта со стадии (b) в контакт в условиях, при которых композиция может мыть объект.

33. Способ стереоселективного гидролиза рацемических смесей сложных эфиров 2-замещенных кислот, включающий следующие стадии:

(a) обеспечение гидролазы по п.11, где гидролаза является стереоселективной;

(b) обеспечение композиции, включающей рацемическую смесь сложных эфиров 2-замещенных кислот; и

(c) приведение полипептида со стадии (а) в контакт с композицией со стадии (b) в условиях, при которых полипептид со стадии (b) может селективно гидролизовать сложные эфиры, где, необязательно, гидролаза иммобилизована и, необязательно, 2-замещенная кислота включает 2-арилоксизамещенную кислоту, R-2-(4-гидроксифенокси)пропионовую кислоту или 2-арилпропионовую кислоту, где, необязательно, 2-замещенная кислота включает кетопрофен.

34. Композиция, включающая гидролазу по п.11, вариант гидролазы по п.35 или фермент, полученный способом по п.37, где, необязательно, композиция представляет собой пищевой продукт, корм, пищевую добавку, кормовую добавку, диетическую добавку или диетическую композицию и где, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция дополнительно включают питательную основу, включающую жир или жир и немного гидролазы или ее отсутствие, или, необязательно, гидролаза активируется солью желчной кислоты, или, необязательно, пищевой продукт, корм, пищевая добавка, кормовая добавка, диетическая добавка или диетическая композиция дополнительно включают состав для детей на основе коровьего молока, или, необязательно, гидролаза может гидролизовать длинноцепочечные жирные кислоты.

35. Способ получения варианта нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с гидролазной активностью, включающий стадии:

(a) обеспечения матричной нуклеиновой кислоты по п.1 и

(b) модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов или их сочетания в матричную последовательность для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты,

где, необязательно, способ дополнительно включает экспрессию варианта нуклеиновой кислоты для получения варианта гидролазного полипептида,

и, необязательно, модификации, добавки или делеции вводятся с помощью метода, включающего подверженную ошибкам ПЦР, перетасовку, олигонуклеотид-специфический мутагенез, сборочную ПЦР, мутагенез со скрещиванием ПЦР, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, мутагенез с рекурсивной сборкой, мутагенез с экспоненциальной сборкой, сайт-специфический мутагенез, Gene Site Saturation Mutagenesis^SM (GSSM^SM), повторную сборку с синтетическим лигированием (SLR или GeneReassembly) и их сочетание, или модификации, добавки или делеции вводятся с помощью метода, включающего рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, мутагенез модифицированной фосфотиоатом ДНК, мутагенез содержащей урацил матрицы, мутагенез дуплекса с пропуском, мутагенез с репарацией точечного несоответствия, мутагенез штамма хозяина с недостаточностью репарации, химический мутагенез, радиогенетический мутагенез, делеционный мутагенез, мутагенез с ограничением-селекцией, мутагенез с ограничением-очисткой, синтез искусственного гена, мутагенез со сборкой, создание мультимера гибридной нуклеиновой кислоты и их сочетание.

36. Способ по п.35, где способ итеративно повторяется до тех пор:

(a) (i) пока не получают гидролазу, обладающую измененной или отличной активностью или измененной или отличной стабильностью, отличных от полипептида, кодируемого матричной нуклеиновой кислотой, где, необязательно, вариант гидролазного полипептида является термоустойчивым и сохраняет некоторую активность после экспозиции при повышенной температуре, или, необязательно, вариант гидролазного полипептида обладает повышенным гликозилированием по сравнению с гидролазой, кодируемой матричной нуклеиновой кислотой, или, необязательно, вариант гидролазного полипептида обладает гидролазной активностью при высокой температуре, где гидролаза, кодируемая матричной нуклеиновой кислотой, не активна при высокой температуре;

(ii) пока не получают кодирующую последовательность гидролазы, характеризуемую использованием кодона, измененного по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой, где, необязательно, способ итеративно повторяется до тех пор, пока не получают ген гидролазы, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии или стабильности мРНК по сравнению с матричной нуклеиновой кислотой; или

(iii) пока не получают гидролазу, обладающую измененной субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, где, необязательно, субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой кислоты из масла, или субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз стеариновой кислоты из масла, или субстратная специфичность или субстратная предпочтительность варианта гидролазы включает предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой и стеариновой кислоты из масла; или

(b) пока не получают гидролазу по (а), где вариант имеет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или более либо все замены аминокислотных остатков (или их эквивалентов), как представлено в табл. 3 или 4.

37. Способ получения фермента, обладающего измененными субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью, включающий:

(a) обеспечение родительской гидролазы по п.11 и

(b) получение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 или более модификаций аминокислотных остатков фермента родительской гидролазы, где, необязательно, модификации аминокислотных остатков соответствуют мутациям аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, как представлено в табл. 3 или 4 (или их эквивалентам), с получением тем самым фермента, обладающего измененными субстратной специфичностью или субстратной предпочтительностью,

где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный или усиленный гидролиз пальмитиновой кислоты,

где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный или усиленный гидролиз стеариновой кислоты,

где, необязательно, измененные субстратная специфичность или субстратная предпочтительность включают предпочтительный гидролиз конкретной жирной кислоты, где, необязательно, жирная кислота представляет собой насыщенную жирную кислоту, где, необязательно, жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.

38. Липаза, включающая аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2, но также включающая:

(a) по меньшей мере, модификацию аминокислотного остатка А48С; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; Е95K; Е116А E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; A144I; Е149Н; A150I; I151G; I151A; P162G; Р162K; V163R; D164R; R172H R172L; A225S или его эквивалента либо их сочетания;

(b) по меньшей мере, модификацию одного кодона (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT); (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG) или его эквивалента либо их сочетания или

(с) липазу по (а), дополнительно включающую, по меньшей мере, модификацию одного кодона (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT); (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG) или его эквивалента либо их сочетания.

39. Липаза, включающая аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:2, но также включающая, по меньшей мере, модификацию одного аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; Н140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или его эквивалента либо их сочетания.

40. Липаза по п.38 или 39, где субстратная специфичность или субстратная предпочтительность новой липазы включают предпочтительный или усиленный гидролиз жирной кислоты по сравнению с "родительской" SEQ ID NO:2, где, необязательно, жирная кислота представляет собой линоленовую кислоту, линолевую кислоту, олеиновую кислоту, пальмитиновую кислоту или стеариновую кислоту.

41. Косметическое средство или крем, включающие липазу по п.38 или 39 либо полипептид по п.11.

42. Фармацевтический агент, липосома, таблетка, капсула, состав или агент для доставки лекарства, включающие липазу по п.38 или 39 либо фермент по п.11.

наверх