(11)	019578 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	200802384
(22)	2007.05.24
(51)	C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/32 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01)
(31)	60/810,499
(32)	2006.06.03
(33)	US
(43)	2009.06.30
(86)	PCT/US2007/012301
(87)	WO 2007/142840 2007.12.13
(71)	(73) ЗИНГЕНТА ПАРТИСИПЕЙШНС АГ (CH)
(72)	Лонг Найколл, Пуллиам Деррик, Боттомс Джефф, Мегджи Моез, Харт Хоуп, Цю Цюдэн (US)
(74)	Веселицкая И.А., Пивницкая Н.Н., Кузенкова Н.В., Веселицкий М.Б., Каксис Р.А., Комарова О.М., Белоусов Ю.В. (RU)
(54)	ВЫДЕЛЕННАЯ МОЛЕКУЛА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

(57) 1. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая уникальна для трансформанта растения кукурузы MIR162, который является устойчивым к широкому спектру чешуекрылых насекомых-вредителей, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 45, SEQ ID №: 47, SEQ ID №: 49, SEQ ID №: 55, SEQ ID №: 59 и комплементарных им последовательностей, которая позволяет диагностировать трансформант MIR162.

2. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, которая кодирует инсектицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID №:2.

3. Ампликон, содержащий нуклеотидную последовательность, указанную в пп.1, 2 и выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 45 и SEQ ID №: 47.

4. Пара полинуклеотидных праймеров, содержащая первый полинуклеотидный праймер и второй полинуклеотидный праймер, которые функционируют вместе в ПЦР реакции в присутствии матрицы ДНК трансформанта растения кукурузы MIR162 в образце для выработки ампликона, который является диагностическим для трансформанта MIR162, где ампликон включает нуклеотидную последовательность, указанную в пп.1-2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 45, SEQ ID №: 47, SEQ ID №: 49, SEQ ID №: 55, SEQ ID №: 59 и комплементарных им последовательностей.

5. Пара праймеров по п.4, в которой последовательность первого праймера и/или последовательность второго праймера включает по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов SEQ ID №: 1.

6. Пара полинуклеотидных праймеров по п.4, в которой последовательность первого праймера является последовательностью генома растения кукурузы или комплементарна последовательности генома растения кукурузы, фланкирующей точку инсерции последовательности гетерологичной ДНК, инсертированной в геном растения кукурузы трансгенного трансформанта MIR162, а последовательность второго полинуклеотидного праймера является последовательностью гетерологичной ДНК или комплементарна последовательности гетерологичной ДНК, инсертированной в геном трансгенного трансформанта MIR162.

7. Пара полинуклеотидных праймеров по п.6, в которой первый полинуклеотидный праймер содержит не менее 10 смежных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, выбираемых из группы, состоящей из нуклеотидов 1-1088 SEQ ID №: 49, нуклеотидов 9391-10579 SEQ ID №: 49 и комплементарных им последовательностей.

8. Пара полинуклеотидных праймеров по п.7, в которой первый полинуклеотидный праймер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 36, SEQ ID №: 39, SEQ ID №: 53, SEQ ID №: 57, SEQ ID №: 68-72, SEQ ID №: 79, SEQ ID №: 80, SEQ ID №: 97-105 и комплементарных им последовательностей.

9. Пара полинуклеотидных праймеров по п.6, в которой второй полинуклеотидный праймер содержит не менее 10 смежных нуклеотидов из нуклеотидов 1089-9390 SEQ ID №: 49 или комплементарных им последовательностей.

10. Пара полинуклеотидных праймеров по п.9, в которой второй полинуклеотидный праймер содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 15-35, SEQ ID №: 37, SEQ ID №: 40, SEQ ID №: 50-52, SEQ ID №: 54, SEQ ID №: 56, SEQ ID №: 57, SEQ ID №: 63, SEQ ID №: 73, SEQ ID №: 82, SEQ ID №: 96 и комплементарных им последовательностей.

11. Пара полинуклеотидных праймеров по п.6, в которой первый полинуклеотидный праймер содержит SEQ ID №: 36, а второй полинуклеотидный праймер содержит SEQ ID №: 37.

12. Пара полинуклеотидных праймеров по п.11 для выработки ампликона, который содержит SEQ ID №: 38.

13. Пара полинуклеотидных праймеров по п.6, в которой первый полинуклеотидный праймер содержит SEQ ID №: 39, а второй полинуклеотидный праймер содержит SEQ ID №: 40.

14. Пара полинуклеотидных праймеров по п.12 для выработки ампликона, который содержит SEQ ID №: 41.

15. Пара полинуклеотидных праймеров по п.6, в которой первый полинуклеотидный праймер содержит SEQ ID №: 53, а второй полинуклеотидный праймер содержит SEQ ID №: 54.

16. Пара полинуклеотидных праймеров по п.15 для выработки ампликона, который содержит SEQ ID №: 55.

17. Пара полинуклеотидных праймеров по п.6, в которой первый полинуклеотидный праймер содержит SEQ ID №: 58, а второй полинуклеотидный праймер содержит SEQ ID №: 56.

18. Пара полинуклеотидных праймеров по п.17 для выработки ампликона, который содержит SEQ ID №: 59.

19. Способ детектирования молекулы нуклеиновой кислоты, которая уникальна для трансформанта растения кукурузы MIR162, в образце, содержащем нуклеиновые кислоты кукурузы, включающий:

(a) контактирование образца с парой праймеров по любому из пп.4-18, которые продуцируют ампликон, являющийся диагностическим для трансформанта MIR162;

(b) проведение реакции амплификации указанной молекулы нуклеиновой кислоты для продуцирования указанного ампликона;

(c) детекцию ампликона, где ампликон содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 45, SEQ ID №: 47, SEQ ID №: 49, SEQ ID №: 55, SEQ ID №: 59 или комплементарные им последовательности.

20. Способ детекции присутствия молекулы нуклеиновой кислоты, которая уникальна для трансформанта растения кукурузы MIR162, в образце, содержащем нуклеиновые кислоты растения кукурузы, включающий:

(a) контактирование образца с зондом, который гибридизуется в условиях высокой строгости с геномной ДНК трансформанта MIR162 и не гибридизуется в условиях высокой строгости с ДНК контрольного растения кукурузы;

(b) выдерживание образца и зонда в условиях гибридизации высокой строгости;

(c) детекцию гибридизации зонда с молекулой нуклеиновой кислоты, где зонд содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, содержащей SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 45, SEQ ID №: 47, SEQ ID №: 49, SEQ ID №: 55, SEQ ID №: 59 и комплементарные им последовательности.

21. Набор для детекции молекулы нуклеиновой кислоты, уникальной для трансформанта растения кукурузы MIR162, содержащий по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты достаточной длины смежных полинуклеотидов в качестве праймера или зонда в способе для детекции указанной нуклеиновой кислоты, где детектируемая последовательность нуклеиновых кислот является уникальной для трансформанта растений кукурузы MIR162 и выбрана из группы, содержащей SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 45, SEQ ID №: 47, SEQ ID №: 49, SEQ ID №: 55, SEQ ID №: 59 и комплементарных им последовательностей.

22. Набор по п.21, в котором молекула нуклеиновой кислоты является праймером, выбранным из группы, состоящей из SEQ ID №: 15-37, SEQ ID №: 39, SEQ ID №: 40, SEQ ID №: 42, SEQ ID №: 43, SEQ ID №: 50-54, SEQ ID №: 56-58, SEQ ID №: 60-105 и комплементарных им последовательностей.

23. Трансгенное растение кукурузы, или ее клетки, или ткани, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

24. Растение кукурузы по п.23, отличающееся тем, что расщепление геномной ДНК растения эндонуклеазой рестрикции KpnI, EcoRV или NcoI ведет к образованию одиночного бэнда гибридизации в условиях гибридизации высокой строгости при использовании зонда, включающего по меньшей мере 10 смежных нуклеотидов SEQ ID №: 1 или комплементарной им последовательности.

25. Растение кукурузы по п.24, отличающееся тем, что зонд содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID №: 13 или/и комплементарную ей последовательность.

26. Семя растения кукурузы, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

27. Трансгенное растение кукурузы, выращенное из семени по п.26.

28. Биологический образец из частей, тканей или семян трансформантов растения кукурузы MIR162, устойчивого к чешуекрылым насекомым-вредителям, содержащий нуклеотидную последовательность, которая выбрана из последовательностей SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 45, SEQ ID №: 47, SEQ ID №: 49, SEQ ID №: 55 или SEQ ID №: 59 или комплементарных им последовательностей.

29. Биологический образец по п.28, который выбран из группы, состоящей из кукурузного крахмала, кукурузной муки, кукурузного сиропа, кукурузного масла и крупы, содержащей побочные продукты кукурузы.

30. Экстракт, полученный из биологического образца по любому из пп.28, 29, содержащий нуклеотидную последовательность, которая выбрана из последовательностей SEQ ID №: 1, SEQ ID №: 38, SEQ ID №: 41, SEQ ID №: 45, SEQ ID №: 47, SEQ ID №: 49, SEQ ID №: 55 или SEQ ID №: 59 или комплементарных им последовательностей.

31. Способ получения растения кукурузы, устойчивого к чешуекрылым насекомым-вредителям, предусматривающий:

(a) половое скрещивание первого родительского растения кукурузы со вторым родительским растением кукурузы, причем указанные первое или второе родительское растения кукурузы содержат нуклеотидную последовательность, указанную в пп.1 и 2, для получения множества растений-потомков первого поколения;

(b) отбор растений-потомков первого поколения, устойчивых к заражению чешуекрылыми насекомыми-вредителями;

(c) самоопыление растений-потомков первого поколения, отобранных на этапе b), с последующим выращиванием множества растений-потомков второго поколения;

(d) отбор растений-потомков второго поколения, устойчивых к чешуекрылым насекомым-вредителям;

причем растения-потомки второго поколения содержат нуклеиновую кислоту, указанную в пп.1, 2.

32. Способ получения гибридных семян растения кукурузы, устойчивого к чешуекрылым насекомым-вредителям, включающий в себя:

(a) высадку семян первой инбредной линии кукурузы, содержащей нуклеотидную последовательность, указанную в пп.1 и 2, и семян второй инбредной линии, имеющих разный генотип;

(b) культивирование растений кукурузы, полученных после высаживания указанных выше семян до момента цветения;

(c) удаление цветков растений одной из инбредных линий кукурузы;

(d) половое скрещивание двух разных инбредных линий друг с другом;

(e) сбор урожая гибридных семян.

33. Способ по п.32, в котором растения первой инбредной линии кукурузы являются материнскими особями.

34. Способ по п.32, в котором растения первой инбредной линии кукурузы являются мужскими особями.

35. Гибридное семя растений кукурузы, полученное согласно способу по п.32.

36. Растение кукурузы, полученное в результате выращивания гибридного семени кукурузы по п.31.

37. Выделенный из трансформанта растения кукурузы MIR162, устойчивого к чешуекрылым насекомым-вредителям, инсектицидный белок, содержащий SEQ ID №: 2.

38. Химерный ген, содержащий последовательность гетерологичного промотора, функционально связанную с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.1, 2.

39. Рекомбинантный вектор, содержащий химерный ген по п.38.

40. Трансгенная клетка-хозяин, содержащая химерный ген по п.38.

41. Трансгенная клетка растения кукурузы, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.

42. Трансгенные ткани кукурузы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты по п.1.