(11)	018049 (13) B1	Разделы: A B C D E F G H
(21)	200971142
(22)	2008.06.05
(51)	C12N 1/15 (2006.01) C12P 21/02 (2006.01) C12N 15/80 (2006.01)
(31)	60/933,894
(32)	2007.06.08
(33)	US
(43)	2010.04.30
(86)	PCT/US2008/007077
(87)	WO 2008/153903 2008.12.18
(71)	(73) ДАНИСКО ЮЭс, ИНК., ДЖЕНЕНКОР ДИВИЖН (US)
(72)	Бауэр Бенджамин С., Ларенас Эдмунд А. (US)
(74)	Медведев В.Н. (RU)
(54)	СИСТЕМА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ И ГОМОЛОГИЧНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗ

(57) 1. Нитевидный гриб, содержащий

первый полинуклеотид, кодирующий первый гетерологичный полипептид, который представляет собой экзоцеллобиогидролазу, эндоглюканазу, бета-глюкозидазу или их домен;

второй полинуклеотид, кодирующий второй гетерологичный полипептид, который представляет собой экзоцеллобиогидролазу, эндоглюканазу, бета-глюкозидазу или их домен, который отличается своей ферментной активностью от указанного выше первого гетерологичного полипептида; и

третий полинуклеотид, кодирующий гомологичный полипептид, который представляет собой целлобиогидролазу, эндоглюканазу, бета-глюкозидазу или их домен, который отличается своей ферментной активностью от указанного выше первого и второго гетерологичного полипептида,

при этом указанный нитевидный гриб может экспрессировать первый и второй гетерологичные полипептиды и гомологичный полипептид; первый и второй гетерологичные полипептиды и гомологичный полипептид образуют функционально активную смесь, где указанный нитевидный гриб является членом подотдела Eumycotina.

2. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый полинуклеотид функционально связан с первым промотором.

3. Нитевидный гриб по п.1, в котором второй полинуклеотид слит с третьим полинуклеотидом, при этом второй и третий полинуклеотиды функционально связаны со вторым промотором.

4. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый полинуклеотид функционально связан с промотором, нативным для гена, кодирующего гомологичный полипептид.

5. Нитевидный гриб по п.1, в котором второй полинуклеотид слит с третьим полинуклеотидом, при этом третий полинуклеотид функционально связан с промотором гена, кодирующего гомологичный полипептид.

6. Нитевидный гриб по п.1, в котором второй полинуклеотид слит с третьим полинуклеотидом с образованием полинуклеотида, кодирующего слитый белок, при этом слитый белок содержит второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид, разделенные линкером.

7. Нитевидный гриб по п.6, в котором слитый белок далее включает сайт расщепления.

8. Нитевидный гриб по п.1, который далее включает четвертый полинуклеотид, кодирующий селектируемый маркер.

9. Нитевидный гриб по п.1, который далее включает четвертый полинуклеотид, кодирующий третий гетерологичный полипептид, при этом указанный нитевидный гриб может экспрессировать третий гетерологичный полипептид.

10. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид является модифицированным гомологичным полипептидом.

11. Нитевидный гриб по п.1, который далее содержит четвертый полинуклеотид, кодирующий третий гетерологичный полипептид, при этом первый и второй гетерологичные полипептиды являются модифицированными гомологичными полипептидами.

12. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид или гомологичный полипептид являются ферментом.

13. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид или гомологичный полипептид являются целлюлазой.

14. Нитевидный гриб по п.1, в котором функционально активная смесь является смесью целлюлаз.

15. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид или гомологичный полипептид являются целлюлазой, выбираемой из группы, состоящей из экзоцеллобиогидролаз, эндоглюканаз и бета-глюкозидаз.

16. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой и второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой.

17. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, выбираемой из группы, состоящей из семейства GH 5, 6, 7, 9 и 48, и второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой, выбираемой из группы, состоящей из семейства GH 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17, 31, 44, 45, 48, 51, 61, 64, 74 и 81.

18. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой и гомологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой.

19. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид является первой экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой и гомологичный полипептид является второй экзоцеллобиогидролазой, при этом первая и вторая экзоцеллобиогидролазы являются одинаковыми целлобиогидролазами.

20. Нитевидный гриб по п.1, который выбран из группы, состоящей из Aspergillus, Acremonium, Aureobasidium, Beauveria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaetomium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Cryptococcus, Cyathus, Endothia, Fusarium, Gilocladium, Humicola, Magnaporthe, Myceliophthora, Myrothecium, Mucor, Neurospora, Phanerochaete, Podospora, Paecilomyces, Penicillium, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophylum, Stagonospora, Talaromyces, Trichoderma, Thermomyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichophyton и Trametes pleurotus.

21. Нитевидный гриб по п.1, который является T.reesei и в котором первый гетерологичный полипептид является cbh1 Humicola grisea, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой 1 Acidothermus cellulolyticus и гомологичный полипептид является cbh1 Trichoderma reesei.

22. Нитевидный гриб по п.1, который является T.reesei и в котором первый гетерологичный полипептид или второй гетерологичный полипептид выбран из группы, состоящей из целлобиогидролазы cbh1 Penicillium funiculosum, эндоглюканаз E3 Thermobifida, эндоглюканаз Е5 Thermobifida, GH74-core и GH48 Acidothermus cellulolyticus.

23. Нитевидный гриб по п.1, который далее включает четвертый полинуклеотид, кодирующий третий гетерологичный полипептид, при этом первый полипептид является модифицированной cbh1 Trichoderma reesei, второй гетерологичный полипептид является модифицированной cbh2 Trichoderma reesei, третий гетерологичный полипептид является эндоглюканазой 1 Acidothermus cellulolyticus и гомологичный полипептид является cbh1 Trichoderma reesei.

24. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой и гомологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, при этом экспрессия первого гетерологичного полипептида, второго гетерологичного полипептида и гомологичного полипептида образует смесь термостойких целлюлаз.

25. Нитевидный гриб по п.1, в котором третий полинуклеотид является внехромосомным полинуклеотидом.

26. Нитевидный гриб по п.1, в котором первый, второй и третий полинуклеотиды являются внехромосомными полинуклеотидами.

27. Способ получения смеси целлюлаз, который включает получение полипептидной смеси из нитевидного гриба по п.1, при этом полипептидная смесь включает первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид.

28. Способ получения смеси целлюлаз, который включает получение полипептидной смеси из нитевидного гриба по п.1, при этом полипептидная смесь включает первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид, из которых первый гетерологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой и гомологичный полипептид является экзоцеллобиогидролазой.

29. Способ получения смеси целлюлаз, который включает получение полипептидной смеси из нитевидного гриба по п.1, при этом полипептидная смесь включает первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид, из которых первый гетерологичный полипептид является первой экзоцеллобиогидролазой, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой и гомологичный полипептид является второй экзоцеллобиогидролазой, где первая и вторая экзоцеллобиогидролазы являются одинаковыми целлобиогидролазами.

30. Способ получения смеси целлюлаз, который включает получение полипептидной смеси из нитевидного гриба по п.1, при этом полипептидная смесь включает первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид, где нитевидный гриб является T.reesei, первый гетерологичный полипептид является cbh1 Humicola grisea, второй гетерологичный полипептид является эндоглюканазой 1 Acidothermus cellulolyticus и гомологичный полипептид является cbh1 Trichoderma reesei.

31. Способ получения смеси целлюлаз, который включает получение полипептидной смеси из нитевидного гриба по п.23, при этом полипептидная смесь включает первый гетерологичный полипептид, второй гетерологичный полипептид, третий гетерологичный полипептид и гомологичный полипептид.