(57) 1. Способ ферментативной продукции витамина С, где клетки хозяина культивируют в подходящих условиях культивации, что позволяет прямую продукцию витамина С из источника углерода, получаемую по пути метаболизма D-глюкозы или D-сорбита, и где геном упомянутой клетки хозяина является генетически измененным с помощью последовательности ДНК, включающей следующие полинуклеотиды:
а) полинуклеотид, кодирующий L-сорбозондегидрогеназу согласно ПОСЛ. № 2, ее активный фрагмент или производное; и
б) хотя бы один полинуклеотид, кодирующий белок, выбранный из белков, вовлеченных в систему метаболизма сорбита/сорбозы (CMC), или белков, вовлеченных в систему дыхательной цепи (СДЦ);
и при необходимости, выделение витамина С из таких клеток или культуральной среды.
2. Способ по п.1, где экспрессия полинуклеотида по п.1а) относится к полинуклеотидной последовательности, которая в значительной степени идентична ПОСЛ. № 1 и/или которую выбирают из группы, состоящей из:
а) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность согласно ПОСЛ. № 1;
б) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, полученную посредством амплификации нуклеиновой кислоты, такой как полимеразная цепная реакция, с применением геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров согласно ПОСЛ. № 3 и ПОСЛ. № 4;
в) полинуклеотидов, включающих нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, включающего аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2 или кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из пп.а) или б), где у упомянутого производного или фрагмента один или более аминокислотный остаток консервативно замещен по сравнению с упомянутым полипептидом и упомянутый фрагмент или производное обладают активностью полипептида, с которым их сравнивают;
г) полинуклеотидов, комплементарные цепочки которых гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2, или полинуклеотидом, как определено по любому из пп.а)-в), которые кодируют полипептид, обладающий активностью L-сорбозондегидрогеназы; и
д) полинуклеотидов, которые не менее чем на 70%, а именно на 85, 90 или 95% идентичны полинуклеотиду, кодирующему полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно ПОСЛ. № 2, или полинуклеотиду, как определено по любому из пп.a)-в), и которые кодируют полипептид, обладающий активностью L-сорбозондегидрогеназы;
или комплементарная цепочка такого полинуклеотида.
3. Способ по п.1 или 2, где упомянутая клетка хозяина включает полинуклеотид, кодирующий СДЦ белок, выбранный из группы, состоящей из белков, занятых в биосинтезе кофакторов и простетических групп и белков, выступающих в роли переносчиков, в частности белков, вовлеченных в биосинтез и развитие кофакторов и/или их предшественников, таких как ФАД, НАД, НАДФ, ПХХ, КоQ10, цитохромы а, b, c, d и гемы.
4. Способ по любому из пп.1-3, где упомянутая клетка хозяина содержит полинуклеотид, кодирующий CMC белок, выбранный из группы, состоящей из оксидоредуктаз [ЕС 1]; в частности оксидоредуктаз, действующих на СН-ОН группу доноров [ЕС 1.1].
5. Способ по любому из пп.1-4, где упомянутая клетка хозяина содержит хотя бы один полинуклеотид, выбранный из
CMC группы, состоящей из ПОСЛ. № 136, ПОСЛ. № 140, ПОСЛ. № 144 и их функциональных эквивалентов или гомологов; и
СДЦ группы, состоящей из ПОСЛ. № 180, ПОСЛ. № 184, ПОСЛ. № 188, ПОСЛ. № 192, ПОСЛ. № 196 и их функциональных эквивалентов или гомологов.
6. Способ по любому из пп.1-5, где упомянутая клетка хозяина является генетически измененной с помощью хотя бы одного полинуклеотида с пониженной экспрессией или поврежденного из CMC группы, состоящей из ПОСЛ. № 124, ПОСЛ. № 128, ПОСЛ. № 132, ПОСЛ. № 44 и их функциональных эквивалентов или гомологов.
7. Способ по любому из пп.1-6, где упомянутую клетку хозяина культивируют в водной питательной среде в условиях, позволяющих прямую продукцию витамина С из D-сорбита или L-сорбозы.
8. Способ по любому из пп.1-7, где генетически измененная клетка хозяина является прокариорической клеткой, выбранной из группы, состоящей из Pseudomonas, Pantoea, Escherichia, Corynebacterium, Ketogulonicigenium и уксусно-кислых бактерий, как, например, Gluconobacter, Acetobacter или Gluconacetobacter, предпочтительно Acetobacter sp., Acetobacter aceti, Gluconobacter frateurii, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter thailandicus, Gluconobacter oxydans, предпочтительно Gluconobacter oxydans, более предпочтительно Gluconobacter oxydans DSM 17078.
9. Клетка хозяина, экспрессирующая полипептид, обладающий L-сорбозондегидрогеназной активностью, с аминокислотной последовательностью согласно ПОСЛ. № 2, и/или содержащая полинуклеотид с ПОСЛ. № 1, или полинуклеотид, гибридизующийся в строгих условиях с ПОСЛ. № 1, причем указанная клетка хозяина генетически изменена с помощью хотя бы одного полинуклеотида, кодирующего белок, выбранный из белков, вовлеченных в систему метаболизма сорбита/сорбозы (CMC), или белков, вовлеченных в систему дыхательной цепи (СДЦ).
10. Клетка хозяина по п.9, где клетка хозяина является генетически измененной с помощью хотя бы одного полинуклеотида, как определено по любому из пп.2-6.
11. Клетка хозяина по п.9 или 10, где экспрессируется белок, выбранный из группы, состоящей из
ПОСЛ. № 137, ПОСЛ. № 141, ПОСЛ. № 145;
ПОСЛ. № 181, ПОСЛ. № 185, ПОСЛ. № 189, ПОСЛ. № 193, ПОСЛ. № 197
и их функциональных эквивалентов или гомологов.
12. Клетка хозяина по любому из пп.9-11, где белок, экспрессируемый на пониженном уровне или поврежденный, выбран из группы, состоящей из ПОСЛ. № 125, ПОСЛ. № 129, ПОСЛ. № 133, ПОСЛ. № 45 и их функциональных эквивалентов или гомологов.
13. Клетка хозяина по любому из пп.9-12, способная прямо продуцировать витамин С из D-сорбита в количествах 300 мг/л или более при измерении по способу для покоящихся клеток после периода инкубации 20 ч.
14. Клетка хозяина по любому из пп.9-12, способная прямо продуцировать витамин С из L-сорбозы в количествах 800 мг/л или более при измерении по способу для покоящихся клеток после периода инкубации 20 ч.
15. Клетка хозяина по любому из пп.9-14, которая является прокариотической клеткой, выбранной из группы, состоящей из Pseudomonas, Pantoea, Escherichia, Corynebacterium, Ketogulonicigenium и уксусно-кислых бактерий, таких как, например, Gluconobacter, Acetobacter или Gluconacetobacter, предпочтительно Acetobacter sp., Acetobacter aceti, Gluconobacter frateurii, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter thailandicus, Gluconobacter oxydans, предпочтительно Gluconobacter oxydans, более предпочтительно Gluconobacter oxydans DSM 17078.
16. Способ получения клеток по п.9, включающий этап генетической модификации клеток с помощью полинуклеотидов, как определено по любому из пп.2-6.
17. Способ по п.16, где хотя бы одна из этих полинуклеотидных последовательностей изменена таким образом, который приводит к улучшенному выходу и/или эффективности получения витамина С у упомянутого микроорганизма.
|
