(57) 1. Способ конъюгации водорастворимого полимера с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка, включающий осуществление контакта окисленного углеводного компонента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые допускают конъюгацию;
причем терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из Фактора IX (FIX), Фактора VIII (FVIII), Фактора VIIa (FVIIa), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), эритропоэтина (ЭПО), интерферона-альфа (ИФН-альфа), ИФН-гамма, ангиопоэтина-2 (Ang-2), фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), эпидермального фактора роста, гормона роста человека (ГРЧ), фактора роста нервов, фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа), рецептора I типа фактора некроза опухолей (ФНО1), рецептора II типа фактора некроза опухолей (ФНО2), инсулина, белка Хумира (адалимумаба), белка Пролиа (деносумаба) или их биологически активного фрагмента;
причем указанный активированный водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруппу и представляет собой полиалкиленгликоль (ПАГ);
при этом активированный водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, получают способом, включающим:
a) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с аминоокси линкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, в которых образуется стабильная оксимная связь между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминоокси линкером, причем указанные условия включают период времени между 1 мин и 24 ч; температуру между 2 и 8°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и
b) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из
хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения при температуре между 2 и 8°С;
причем указанный углеводный компонент окисляют путем инкубации с буферным раствором, содержащим окисляющий агент, выбранный из группы, состоящей из перйодата натрия (NaIO₄), тетраацетата свинца (Pb(OAc)₄) и перрутената калия (KRuO₄);
при этом оксимная связь образуется между окисленным углеводным компонентом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера; и
при этом образование оксимной связи катализируется м-толуидином.
2. Способ конъюгации водорастворимого полимера с окисленным углеводным компонентом терапевтического белка, включающий осуществление контакта окисленного углеводного компонента с активированным водорастворимым полимером в условиях, которые допускают конъюгацию;
причем терапевтический белок представляет собой гликопротеин или терапевтический белок, гликозилированный in vitro, и выбран из группы, состоящей из Фактора IX (FIX), Фактора VIII (FVIII), Фактора VIIa (FVIIa), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), ЭПО, интерферона-альфа (ИФН-альфа), ИФН-гамма, Ang-2, фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), эпидермального фактора роста, гормона роста человека (ГРЧ), фактора роста нервов, фактора некроза опухолей альфа (ФНО-альфа), рецептора I типа фактора некроза опухолей, рецептора II типа фактора некроза опухолей, инсулина, белка Хумира (адалимумаба), белка Пролиа (деносумаба), или их биологически активного фрагмента;
причем указанный водорастворимый полимер содержит активную аминооксигруппу и представляет собой полиалкиленгликоль (ПАГ);
при этом водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу, получают способом, включающим:
а) инкубирование раствора, содержащего неокисленный водорастворимый полимер с аминоокси линкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, в которых образуется стабильная оксимная связь между водорастворимым полимером и активированным аминоокси линкером, причем указанные условия включают период времени между 1 мин и 24 ч; температуру между 22 и 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и
b) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения;
причем указанный углеводный компонент окисляют путем инкубации с буферным раствором, содержащим окисляющий агент, выбранный из группы, состоящей из перйодата натрия (NaIO₄), тетраацетата свинца (Pb(OAc)₄) и перрутената калия (KRuO₄);
при этом оксимная связь образуется между окисленным углеводным компонентом и активной аминооксигруппой водорастворимого полимера; и
при этом образование оксимной связи катализируется м-толуидином.
3. Способ по п.2, где указанные условия на стадии а) дополнительно включают стадию повышения температуры раствора до температуры от 32 до 37°С и инкубацию дополнительно в течение 12-24 ч.
4. Способ по любому из пп.1-3, где водорастворимый полимер выбирают из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полипропиленгликоля (ППГ), разветвленного ПЭГ и полиэтиленгликоля марки PolyPEGÒ (Warwick Effect Polymers; Coventry, UK).
5. Способ по любому из пп.1-3, где водорастворимый полимер выбирают из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полипропиленгликоля (ППГ).
6. Модифицированный терапевтический белок, полученный способом по любому из пп.1-5, содержащий терапевтический белок, конъюгированный с водорастворимым полимером через образование оксимной связи.
7. Способ получения водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, включающий:
а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер с аминоокси линкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, в которых образуется стабильная оксимная связь между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминоокси линкером, причем указанные условия включают период времени между 1 мин и 24 ч; температуру между 2 и 8°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и
b) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, способом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения при температуре между 2 и 8°С;
причем полученный водорастворимый полимер представляет собой полиалкиленгликоль (ПАГ) с оксимной связью между водорастворимым полимером и аминоокси линкером.
8. Способ получения водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, включающий:
a) инкубирование раствора, содержащего неокисленный водорастворимый полимер, с аминоокси линкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, в которых образуется стабильная оксимная связь между водорастворимым полимером и активированным аминоокси линкером, указанные условия включают период времени между 1 мин и 24 ч; температуру между 22 и 37°С; присутствие или отсутствие света и наличие или отсутствие перемешивания; благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и
b) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу методом, выбранным из группы, состоящей из хроматографии, фильтрации, диализа и осаждения;
причем полученный водорастворимый полимер представляет собой полиалкиленгликоль (ПАГ) с оксимной связью между полимером и аминоокси линкером.
9. Способ получения водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, включающий:
а) инкубирование раствора, содержащего окисленный водорастворимый полимер, с аминоокси линкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, в которых образуется стабильная оксимная связь между окисленным водорастворимым полимером и активированным аминоокси линкером, указанные условия включают период времени 1 ч; температуру 4°С; отсутствие света и наличие перемешивания; благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащая активную аминооксигруппу; и
b) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, анионообменной хроматографией при температуре 4°C; указанный активированный аминоокси линкер представляет собой 3-оксапентан-1,5-диоксиаминный линкер формулы:

причем полученный водорастворимый полимер представляет собой полиалкиленгликоль (ПАГ) с оксимной связью между водорастворимым полимером и аминоокси линкером.
10. Способ получения водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, включающий:
а) инкубирование раствора, содержащего неокисленный водорастворимый полимер, с аминоокси линкером, содержащим активную аминооксигруппу, в условиях, в которых образуется стабильная оксимная связь между неокисленным водорастворимым полимером и активированным аминоокси линкером, указанные условия включают период времени 2 ч; температуру 22°С; отсутствие света и наличие перемешивания; благодаря чему образуется водорастворимый полимер, содержащий активную аминооксигруппу; и
b) очистку водорастворимого полимера, содержащего активную аминооксигруппу, методом диализа при температуре 22°С;
указанный активированный аминоокси линкер представляет собой 3-оксапентан-1,5-диоксиамин­ный линкер формулы

причем полученный водорастворимый полимер представляет собой полиалкиленгликоль (ПАГ);
причем оксимная связь образуется между неокисленным водорастворимым полимером и аминоокси линкером.
11. Способ по п.10, где указанные условия на стадии а) дополнительно включают стадию повышения температуры раствора до температуры от 32 до 37°С и инкубацию дополнительно в течение 12-24 ч.
12. Способ по любому из пп.7-11, где водорастворимый полимер выбирают из полиэтиленгликоля (ПЭГ), полипропиленгликоля (ППГ), разветвленного ПЭГ и полиэтиленгликоля марки PolyPEGÒ (Warwick Effect Polymers; Coventry, UK).
13. Способ по любому из пп.7-11, где водорастворимый полимер выбирают из полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полипропиленгликоля (ППГ).

---